مفاعل حيوي متعدد العظة لتقييم القدرة الالتهابية والتجديدية للمواد الحيوية تحت التدفق والتمدد

حتى الآن ، كان من الصعب حقا تحديد علاقات السبب والنتيجة بين ديناميكا الدم وتجديد أنسجة الأوعية الدموية. وهذا لأنه من الصعب التحكم في الأحمال الميكانيكية الفردية. يمكننا هذا المفاعل الحيوي من التحقيق ميكانيكيا في التأثيرات الفردية والمشتركة للإجهاد المطلق والتمدد الدوري على الإمكانات التجديدية لمجموعة متنوعة من ترقيع الأوعية الدموية المصممة للأنسجة الهندسية.

ستظهر هذا الإجراء سوزان كوخ ، مرشحة الدكتوراه في مجموعتنا. والدكتورة تمار ويسينج وهي باحثة ما بعد الدكتوراه من مختبرنا. لتركيب السقالة الكهربائية المغزولة على أنبوب السيليكون ، قم بربط خياطة 4-0 برولين في أحد طرفي قطعة من أنابيب السيليكون وخارجها من الطرف الآخر.

اصنع عقدة صغيرة على جانبي الأنبوب مع ترك ما يقرب من 10 سنتيمترات من الأسلاك على كلتا العقدتين وقم بعمل عقدة ثالثة فوق العقدين. بعد إزالة إبرة الخياطة ، قم بقص حواف أنبوب السيليكون إلى شكل مثلث وقم بعمل عقدة نهائية في نهاية السلكين بطول 10 سم. اغمس السقالة الكهربائية المغزولة في 30٪ من الإيثانول وضع السقالة فوق أحد طرفي سلك الخياطة الحرة.

بعد ذلك ، قم بتمديد جانبي أنبوب السيليكون برفق وعقدة الخياطة التي يبلغ طولها 10 سم بينما يستخدم الباحث الثاني ملاقطا ذات طرف داخلي أملس لتحريك السقالة الكهربائية المغزولة برفق فوق الأنبوب. حرر التمدد ببطء على أنبوب السيليكون مع تنعيم السقالة الكهربائية المغزولة في نفس الوقت باستخدام الملقط. واغمس السقالة وأنابيب السيليكون في ماء نقي للغاية مرتين.

قم ببناء المقصورة السفلية وتأكد من وضع الحلقة O بشكل صحيح. ضع جلبة محول في الجزء العلوي من المقصورة السفلية وضع قناة الضغط بها ثقوب من خلال المقصورة السفلية. قم بربط حلقة O المصنوعة من السيليكون حول الطرف السفلي من قناة الضغط لمنع التسرب.

وقم بربط الجزء السفلي من المقصورة السفلية بالجزء العلوي من المقصورة السفلية لتأمين قناة الضغط. تأكد من أن الأخدود المحفور السفلي لقناة الضغط يقع على ارتفاع ثلاثة إلى خمسة ملليمترات تقريبا فوق حافة جلبة المحول في المقصورة السفلية. اسحب أنبوب السيليكون باستخدام السقالة الكهربائية المغزولة فوق قناة الضغط وقم بإيماءة وسلك الخياطة في الطرف السفلي من السقالة الكهربائية المغزولة ، في موقع الأخدود المحفور على قناة الضغط.

قم بإيماءة ثانية على الجانب الآخر لتأمين أنبوب السيليكون بإحكام باستخدام الكسب غير المشروع الكهربائي. ووضع مشبك مقص مزود بقاعدة في الطرف العلوي من أنبوب السيليكون ، اسحب مشبك المقص لأعلى بطريقة متسقة واسحب سقالة التكاثر الكهربائية برفق لإزالة أي تجاعيد. استخدم سلك خياطة لعمل عقدتين على طرفي السقالة عند الأخدود العلوي المحفور لقناة الضغط.

عند عمل كلتا العقدتين ، حرر المشبك المقص واستخدم سكينا لإزالة أي أنابيب سيليكون زائدة. قم بربط مخاريط الأنف على الخيط اللولبي لقنوات الضغط للعينات التي سيتم تحميلها ديناميكيا. اغمس قناة الضغط والأنابيب والسقالة مرة واحدة في 30٪ من الإيثانول ومرتين في ماء فائق النقاء لترطيب الإعداد مسبقا.

ضع الأنبوب الزجاجي فوق قناة الضغط وادفع برفق على المقصورة السفلية لتثبيت الأنبوب الزجاجي في مكانه. ثم ضع مكواة فرد التدفق ، وحلقة سيليكون O ، وجلبة محول في المقصورة العلوية. وقم بتأمين المقصورة فوق الطرف المفتوح للأنبوب الزجاجي.

قم بإزالة سدادة الإغراء الذكرية من مخرج التدفق ، واعمل في خزانة تدفق رقائقية معقمة. افتح غطاء الإغراء الأبيض وضع منديل نقع الإيثانول أمام مخرج التدفق. قم بتفكيك غرفة ثقافة التدفق عن طريق خلع الأنبوب الزجاجي بالمقصورة العلوية.

ضع أنبوب مراعي مفرغ وأضفه على السقالة الكهربائية المغزولة لإزالة أكبر قدر ممكن من الوسط. وأضف محلول الفيبرينوجين بنسبة واحد إلى واحد مع تعليق الخلية المكملة بالثرومبين. قم بتمرير المحلول لأعلى ولأسفل مرة واحدة وقم بتقطير المحلول على الفور على طول السقالة بالكامل.

عندما يتم تسليم جميع الخلايا ، حرك السقالة ببطء من اليسار إلى اليمين ولأعلى ولأسفل لتحقيق توزيع متساو للخلايا. عندما يتم زرع جانبي السقالة ، أعد بناء غرفة ثقافة التدفق بعناية عن طريق إعادة الأنبوب الزجاجي والمقصورة العلوية. ووضع غرفة ثقافة التدفق في الحاضنة للسماح للألياف بالتصلب.

لإقران المفاعل الحيوي بنظام المضخة ، ضع غرفة ثقافة التدفق على أحد الخيوط اللولبية الثمانية على قاعدة المفاعل الحيوي. ووضع مقطع مضيف على الأنبوب المتوسط. قم بإزالة غطاء الإغراء الأبيض ، الذي يغطي مدخل التدفق للحجرة العلوية لغرفة ثقافة التدفق وقم بإزالة مقرنة الإغراء الأنثوية للأنبوب المتوسط.

قم بتوصيل الأنبوب المتوسط بجانب واحد من مدخل التدفق في المقصورة العلوية. والجانب الآخر مع مخرج التدفق في المقصورة السفلية. انقل الإعداد الكامل من خزانة التدفق الصفحي إلى الحاضنة.

وقم بتوصيل وحدات السوائل وقاعدة المفاعل الحيوي بأنابيب ضغط الهواء والكابل الكهربائي. ابدأ البرنامج وتهيئة المضخات. ابدأ التدفق المتوسط للعينات واحدة تلو الأخرى.

ثم قم بتغيير معلمات مضخة الإجهاد إلى الإعدادات المطلوبة وابدأ الإجهاد. راقب التمدد المطبق على السقالة كل يومين. تظهر مراقبة إجهاد التمدد وقص الجدار على مدى فترات الاستزراع طويلة الأجل أنه يمكن الحفاظ على هذه القيم عند مستويات ثابتة نسبيا على مدى فترة تصل إلى 20 يوما.

بعد ثلاثة أيام من التحميل الديناميكي الدموي ، يكشف تلطيخ الفلورسنت المناعي عن توزيع متجانس للبلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية والخلايا الليفية العضلية في جميع أنحاء السقالة. بعد 20 يوما من الزراعة المشتركة ، يؤدي التمدد الدوري إلى ترسب ألياف الكولاجين من النوع 1 الأكثر عددا وسمكا. أثناء وجوده في مجموعة الحمل الديناميكي الدموي المجمعة ، يتم إلغاء تأثير التمدد الدوري من خلال الإجهاد المطلق مما يؤدي إلى ترسب أقل وضوحا من الكولاجين من النوع 1.

بعد ثمانية أيام من الزراعة الأحادية للبلاعم ، لوحظ تآكل الألياف وانقسام الألياف في جميع أنظمة التحميل الديناميكي الدموي مع الارتشاف الأكثر وضوحا الذي لوحظ في المجموعة الساكنة ، والارتشاف الأقل وضوحا لوحظ في مجموعة الإجهاد المطلق. يؤثر كل من التمدد الدوري والإجهاد المطلق على ملف إفراز السيتوكين لإعداد الزراعة المشتركة. ومن المثير للاهتمام أن التأثيرات المجمعة لكلا الحمولين تظهر إما هيمنة أحد الحمولين أو التأثيرات التآزرية لكلا الحمولين.

تظهر تجارب الزراعة المشتركة أيضا أن البيئة الميكانيكية والبيئات الالتهابية المعتمدة على التحميل الناتجة تعدل النمط الظاهري للأرومات الليفية العضلية. علاوة على ذلك ، ترتبط أنماط التعبير الجيني لأكتين العضلات الملساء ألفا ذات العلامة الانقباضية بتخليق البروتين. أهم شيء عند تنفيذ هذا البروتوكول هو أن هذا هو تطبيق التمدد ، من الضروري أن يكون الإعداد الخاص بك خاليا من التسرب.