تنقية توبولين مع التعديلات ما بعد النقل الخاضعة للرقابة وIsotypes من مصادر محدودة من قبل دورات البلمرة- Depolymerization

تسمح هذه الطريقة بتوليد توبولين نقي مختص بالتجميع مع تعديلات محددة بعد الترجمة بكميات كافية لإجراء مجموعات كاملة من التجارب في المختبر. من السهل تنفيذ هذا البروتوكول القائم على دورات بلمرة التوبولين وإزالة البلمرة في أي مختبر بيولوجيا الخلية. يسمح بتوليد كميات جيدة من التوبولين مع القليل جدا من الوقت العملي.

لتنقية التوبولين من مزارع التعليق ، قبل تسعة أيام من إعداد التوبولين ، قم بإحياء وتضخيم نوع الخلية المطلوب للحصول على ستة أطباق متقاربة بطول 15 سم. قبل ثمانية أيام من تحضير التوبولين ، أضف لترا واحدا من الوسط الدافئ مسبقا إلى كل زجاجة دوارة لكل طبق تحت خزانة زراعة الخلايا وضع المغازل على طاولة تقليب داخل حاضنة زراعة الخلايا. اترك أغطية الدوار الجانبية مفتوحة قليلا للسماح للوسيط بالتوازن مع جو الحاضنة.

في اليوم التالي ، استخدم الخلايا من الأطباق المتقاربة لتلقيح الزجاجات الدوارة. أعد الزجاجات الدوارة إلى الحاضنة لمدة أسبوع مع فتح الصمامات الجانبية قليلا. لحصاد الخلايا ، انقل الثقافات من زجاجات الدوار إلى زجاجات طرد مركزي سعة لتر واحد واجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

أعد تعليق كل حبيبات في 10 ملليلتر من PBS المثلج ، وقم بتجميع الخلايا المعلقة في أنبوب سعة 50 مليلتر للطرد المركزي عند أربع درجات مئوية. للحصول على 10 بيليه خلية ملليلتر, أضف 10 ملليلتر من مخزن التحلل إلى الحبيبات, وقلب الأنبوب عدة مرات لإعادة تعليق الخلايا. لتنقية التوبولين من مزارع الخلايا الملتصقة ، قم بإحياء وتضخيم نوع الخلية المطلوب للحصول على 10 أطباق متقاربة بطول 15 سم في يوم تحضير التوبولين.

لحصاد الخلايا الملتصقة ، ومعالجة ثلاثة أطباق في وقت واحد ، قم بإمالة أطباق الثقافة لإزالة الوسط بينما يقوم شخص ثان بغسل الخلايا برفق بسبعة ملليلتر من PBS-EDTA. بعد الغسيل ، يجب على الشخص الثاني معالجة الخلايا بخمسة ملليلتر من PBS-EDTA لكل طبق قبل أن يستخدم شخص ثالث رافع الخلايا لدفع الخلايا برفق إلى حافة واحدة من الطبق. عندما يتم فصل الخلايا ، قم بتجميع الخلايا من جميع الأطباق الثلاثة في أنبوب سعة 50 مليلتر على الجليد واشطف كل طبق بملليلترين إضافيين من PBS-EDTA لجمع أي خلايا متبقية.

بعد جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية لتحديد حجم حبيبات الخلية. أضف المخزن المؤقت للتحلل ، وأعد تعليق الخلايا ، وانقلها إلى أنبوب سفلي دائري سعة 14 ملليلترا. صوتنة الخلايا لحوالي 45 نبضة.

لتحلل دماغ الفأر ، أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت المرخص إلى دماغ واحد تم حصاده من فأر بالغ واستخدم خلاط الأنسجة لتحلل الأنسجة. بعد الحصول على المحللة عند 1/100 من حجمها إلى حجم متساو من 2X Laemmli ، قم بغلي المحلول لمدة خمس دقائق. قم بتخزينه عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى القياس الكمي.

اجمع عينة بهذه الطريقة في كل خطوة من خطوات إعداد التوبولين. لتوضيح المحللة ، قم بالطرد المركزي للعينة واستخدم إبرة طويلة لنقل المادة الطافية الصافية بعناية إلى أنبوب جديد ، مع الحرص على تجنب الطبقة العائمة العليا. بعد توضيح المحللة ، من الضروري إزالة المادة العائمة في المادة الطافية ، وإلا فقد تؤثر سلبا على كفاءة تنقية التوبولين.

لبلمرة التوبولين من المحللة المصفاة ، امزج الحجم الكامل للطاف مع حجم 1/200 من 0.2 مولار GTP ونصف حجم من الجلسرين الدافئ في أنبوب بحجم مناسب. ماصة الخليط برفق ، واحرص على تجنب إدخال فقاعات الهواء. أغلق الأنابيب بالبارافيلم وضعها في حمام مائي 30 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

بعد الطرد المركزي ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. لإزالة بلمرة الأنابيب الدقيقة الموجودة في الحبيبات الثانية ، أعد تعليق الحبيبات في الجليد BRB 80 لمدة خمس دقائق على الجليد. قم بسحب العينة أولا بماصة P1000، ثم بماصة P200، كل خمس دقائق لمدة 20 دقيقة على الجليد.

بمجرد أن تصبح العينة متجانسة ، قم بطردها ونقل المادة الطافية التي تم الحصول عليها إلى أنبوب جديد. لإزالة البروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة من التوبولين ، امزج الحجم الكامل للطاف ثلاثة بحجم متساو من أنبوب مولي واحد مسخن مسبقا S ، ونفس حجم الجلسرين المسخن مسبقا وحجم 1/100 من 0.2 مولار GTP. احتضن المزيج لمدة 20 دقيقة عند 30 درجة مئوية قبل الطرد المركزي.

انقل المادة الطافية المحتوية على البروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة إلى أنبوب جديد ، تحتوي الحبيبات على أنابيب دقيقة مبلمرة. بعد إجراء بلمرة ثالثة وإزالة البلمرة ، يمكن قياس كمية التوبولين المحصود عن طريق تحليل صفحة SDS. يمكن تأكيد نجاح عملية التنقية على صفحة SDS الملطخة ب Coomassie.

يمكن أن يكون العائد الأقل من المتوقع للتوبولين المنقى ناتجا عن بلمرة التوبولين غير الفعالة كما يتضح من انخفاض كمية التوبولين في كسور الحبيبات الثانية والرابعة والسادسة وكمية أعلى في الكسور الطافية الثانية والرابعة والسادسة. لتحديد كمية التوبولين المنقى ، يمكن تشغيل العينات بجانب كميات معروفة من ألبومين مصل الأبقار. ثم يسمح قياس الكثافة الكمي لنطاقات البروتين بحساب كمية التوبولين المنقى.

يمكن تأكيد حالة تعديل التوبولين عن طريق تحليل اللطخة المناعية للعينات. يسمح بروتوكولنا بعزل التوبولين مع تعديلات ما بعد الترجمة الخاضعة للرقابة. باستخدام هذا التوبولين ، يمكننا إعداد تجارب إعادة التكوين في المختبر التي تسمح لنا بتحديد تأثير تعديلات التوبولين على خصائص الأنابيب الدقيقة ، وكذلك على تفاعلاتها مع البروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة.