تغذية وقياس الدم المشتق من الحيوانات والوجبات الاصطناعية في البعوض Aedes aegypti

تسمح هذه التقنية للباحثين بإطعام وإجراء قياسات عالية الإنتاجية بمفردهم لمقارنة أحجام الوجبات التي يستهلكها مئات البعوض الفردي. يمكن أن يكون تكييفيا لتغيير محتوى الوجبة ، أو لمقارنة الحجم الذي تستهلكه المجموعات التجريبية المختلفة. يهدف هذا البروتوكول إلى أن يكون سهل الاستخدام ومنخفض التكلفة.

للتلاعب الدوائي والجيني ، لدراسة تغذية البعوض بالدم وسلوك التغذية بعد الفيضانات. التنظيم أمر بالغ الأهمية لهذا البروتوكول. قم بإعداد الإعداد والكواشف مسبقا ، بحيث يمكنك توصيل وجبات الطعام بسرعة إلى البعوض.

للبدء ، قم بنقل 1.98 إلى ملليلترين من دم الأغنام منزوع التيفي إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. في حالة إجراء القياس الكمي القائم على التألق لحجم الوجبة ، أضف محلول الفلورسين إلى التركيز النهائي بنسبة 0.002٪ لتقليل حجم الدم بنفس كمية الفلورسين المضافة. احتفظ بملليلتر واحد من تركيبة الوجبة النهائية لتوليد المنحنى القياسي المرجعي.

يجب تغليف جميع الوجبات والمحاليل التي تحتوي على الفلورسين بورق الألمنيوم أو حفظها في الظلام. لتحضير وجبات ملحية خالية من البروتين ، امزج 600 ميكرولتر من بيكربونات الصوديوم 400 مللي مولار مع 1.39 مل من الماء المقطر المزدوج في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. إذا كان سيتم إجراء القياس الكمي القائم على التألق لحجم الوجبة لاحقا ، أضف محلول الفلورسين إلى التركيز النهائي بنسبة 0.002٪ لتقليل حجم الماء بنفس كمية الفلورسين المضاف.

احتفظ بما لا يقل عن مليلتر واحد من تركيبة الوجبة النهائية التي تحتوي على 0.002٪ فلورسين لتوليد منحنى المعيار المرجعي. ضعي الوجبات الجاهزة جانبا حتى تصبح جاهزا لتوصيلها. يجب تغليف جميع الوجبات والمحاليل التي تحتوي على الفلورسين بورق الألمنيوم أو حفظها في الظلام.

ضع المجموعة التجريبية من إناث البعوض في وعاء وقم بتغطيتها بشبكة. اسمح لهؤلاء الإناث بالتأقلم في غرفة التغذية. ضع جانبا مجموعة تحكم من البعوض غير الذي لم يتغذى عليه والذي لن يقدم لك وجبة.

لبناء أنبوب GLI ، املأ أنبوبا مخروطي سعة 50 مليلتر ب 40 مليلتر من الجلسرين بنسبة 100٪. أغلق الأنبوب المخروطي المفتوح بقطعتين من البارافيلم لتقليل فرصة التسرب. اختياريا ، أمسك البارافيلم في مكانه باستخدام الأربطة المطاطية.

اقلب الأنبوب للتأكد من عدم وجود ثقوب أو فجوات. لإنشاء جهاز توصيل الوجبات ، قم بقطع ثقب مركزي يبلغ 2.5 سم في الغطاء اللولبي للأنبوب المخروطي باستخدام شفرة حلاقة حادة أو حفرة. تمتد ، قطعة من البارافيلم بالتساوي بحيث يتضاعف حجمها تقريبا.

يجب أن يكون البارافيلم رقيقا بدرجة كافية بحيث يمكن للبعوض أن يخترقه بسهولة ولكن يجب ألا يكون هناك تسرب. أغلق السطح الخارجي للغطاء اللولبي بالبارافيلم لتغطية الفتحة بالكامل ، واترك الغطاء جانبا. قم بتسخين كل من أنبوب الجلسرين المغلق ووجبات الدم والمحلول الملحي وحمام مائي من 42 إلى 45 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل.

أضف ATP إلى الوجبة الدافئة والدوامة جيدا. ماصة ملليلترين من الوجبة الدافئة في الغرفة الداخلية للغطاء اللولبي ووضعت برفق الأنبوب المخروطي المملوء بالجلسرين المقلوب الدافئ عليها. جزئيا ، قم بربط الغطاء مع الوجبة على الأنبوب المملوء بالجلسرين ، وهو ما يكفي لمنع تسرب الوجبة أو الجلسرين.

ضع أنبوب gly المجمع أعلى حاوية البعوض ، واستخدم ثاني أكسيد الكربون واسمح للبعوض بالوصول إلى التغذية لمدة 15 دقيقة على الأقل لتحقيق أقصى معدلات تغذية. بعد الرضاعة ، يمكن التخلص من غطاء أنبوب GLI كنفايات بيولوجية أو إعادة استخدامه بعد نقعه في محلول مبيض منخفض النسبة وشطفه جيدا في الماء. لإنشاء منحنى قياسي مرجعي ، قم بإعداد تخفيف تسلسلي لنفس الوجبة التي تحتوي على 0.002٪ فلورسين تم تقديمها للمجموعة التجريبية من البعوض.

لعمل الحل الأول للمنحنى القياسي ، أضف 50 ميكرولترا من الوجبة التي تحتوي على 0.002٪ فلورسين إلى 950 ميكرولتر من PBS والدوامة جيدا. قم بإجراء تخفيفات مزدوجة لبقية حلول المنحنى القياسية ، مع الدوران جيدا قبل كل تخفيف. ماصة 100 ميكرولتر من كل من حلول المنحنى القياسية في كل من الآبار الثمانية في العمود الأول من لوحة PCR المكونة من 96 بئرا.

أضف بعوضة واحدة مخدرة أو مجمدة غير مغذية إلى كل من الآبار الثمانية نفسها. كرر في العمود الثاني من اللوحة لقياس تكرار. أضف 100 ميكرولتر من PBS إلى كل بئر متبقي للمجموعات الضابطة والتجريبية غير المغذية.

كعنصر تحكم سلبي ، أضف بعوضة واحدة غير مغذية إلى كل بئر في العمودين التاليين من اللوحة. أضف بعوضة واحدة لكل بئر إلى الآبار المتبقية من المجموعات التجريبية التي قدمت لها وجبة. أضف حبات زجاجية صلبة من البورسليكات بثلاثة ملليمترات إلى كل بئر في حالة تعطيل الأنسجة باستخدام الخالط مطحنة الخرز.

أغلق اللوحة بعناية وقم بتعطيل الأنسجة ثم قم بالطرد المركزي للوحة عند 2000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة إلى دقيقتين لجمع المحلل. قم بإعداد صفيحة سوداء سعة 96 بئرا تحتوي على 180 ميكرولتر من PBS في كل بئر. ثم أضف 20 ميكرولترا من المحللة إلى كل بئر واخلطها.

قم بقياس شدة الفلورسين باستخدام قارئ لوحة مع 485 قناة إثارة و 520 قناة انبعاث. قم بإنشاء المنحنى القياسي المرجعي عن طريق رسم الحجم المعروف للوجبة مقابل قياس شدة التألق المقابل. باستخدام المنحنى القياسي المرجعي الذي تم إنشاؤه ، استقراء حجم الوجبة الذي ابتلعته كل بعوض من بعوض المجموعة التجريبية.

اطرح متوسط قراءة شدة التألق لمجموعة التحكم السلبية غير المغذية من قراءة شدة التألق لكل فرد في المجموعة التجريبية لتصحيح التألق الذاتي للأنسجة الأساسية. لقياس حجم وجبة الفلورسين من تجربة تغذية الدم ، تم إنشاء منحنى قياسي عن طريق رسم قراءات التألق من الآبار المرجعية المعينة التي تحتوي على بعوضة غير مغذية وحجم معروف من الوجبة بنسبة 0.002٪ فلورسين. تتم مقارنة قراءات الآبار المتبقية التي تحتوي على بعوض من مجموعة البعوض السلبية غير المغذية ، أو المجموعة التجريبية من البعوض التي تقدم وجبة ، بهذا المنحنى القياسي لتحديد حجم الوجبة المستهلكة.

على الرغم من أن جميع الإناث في المجموعة التجريبية حصلن على وجبة الدم ، إلا أن بعض البعوض أتغذى والبعض الآخر لم يتغذ. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتقديم وتحديد الوجبات بتركيبات بروتين مختلفة. يتم عرض البيانات التي تم جمعها باستخدام وجبات تحتوي على الفلوريسين المضاف هنا.

كما أجريت تجربة مستقلة حيث تم تسجيل البعوض على أنه يتغذى أو لا يتغذى بالعين ، بعد أن تم تقديم وجبات بدون فلوريسين. تم استخدام هذا البروتوكول لتحديد حجم الوجبات المستهلكة بالأدوية التي تنظم سلوك مضيفات البعوض. في هذه التجارب ، تم تقديم وجبات من الإناث محلول ملحي و ATP مع ناهض مستقبلات NPY البشري.

تم استخدام هذه التقنية أيضا لقياس سلوك تغذية الرحيق ، عن طريق استبدال أنبوب gly بكرة قطنية مشبعة بنسبة 10٪ سكروز تحتوي على 0.002٪ فلورسين ، مما يدل على أنه يمكن استخدامها لقياس أحجام الوجبات الأصغر أو الأكثر تنوعا التي لا يمكن تمييزها بدقة من قياسات وزن المجموعة. أهم شيء عند تنفيذ هذا البروتوكول ، هو تنظيم العينات في الأحداث وتخصيص البعوض غير المغذى ومل واحد من كل وجبة لتوليد المنحنى القياسي. باتباع هذا الإجراء ، يمكن ملاحظة سلوك بعد تغذية الدم ويمكن تتبع الهضم.

تسمح هذه الطريقة للباحثين بتقييم التغيرات في استهلاك الوجبات في البعوض المعدل وراثيا. كما أنه يوفر طريقة مباشرة وسريعة وغير جراحية لتوصيل الأدوية إلى البعوض واختبار آثارها على السلوك.