PCR موتاجينيسيس، الاستنساخ، التعبير، بروتوكولات تنقية البروتين السريع وتبلور النوع البري وأشكال متحولة من التربتوفان سينتاس

هذا البروتوكول لتنقية إنزيم التربتوفان سينسيز من السالمونيلا التيفيموريوم سريع وبسيط وقصير. يتيح تجزئة كبريتات الأمونيا وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم تنقية النوع البري ومركب سينسيز التربتوفان المتحور في يوم واحد. يمكن تطبيق هذه التقنية لتنقية البروتينات الأخرى ذات الصلة حيث يتم استخدام تجزئة كبريتات الأمونيا وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم بشكل شائع لتنقية البروتينات غير الموسومة.

للبدء ، قم بتعطيل بيليه الخلية عن طريق صوتنة على حمام ماء مثلج بسعة 80٪ لمدة 20 دورة باستخدام نبضات مدتها 10 ثوان و 20 ثانية من الراحة. الطرد المركزي للخلية تحلل عند 30 ، 000 مرة جم لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية ، وشفط المادة الطافية دون إزاحة الحبيبات. قم بتصفية الجزء الطافي المصفف بمرشح 0.45 ميكرومتر في درجة حرارة الغرفة.

أضف كميات صغيرة من كبريتات الأمونيوم ببطء إلى المرشح حتى يتم الوصول إلى 20٪ من التشبع. قم بإجراء تجزئة كبريتات الأمونيوم عند 25 درجة مئوية ، وحرك المحلول برفق لمدة 10 دقائق ، مع الحرص على تجنب الفقاعات. قم بالطرد المركزي للمحلول مرة أخرى لمدة 10 دقائق ، وانقل المادة الطافية إلى قارورة نظيفة لمزيد من الاستخدام.

أعد تعليق الحبيبات برفق في 20 مل من المخزن المؤقت للعينة ، وقم بإعداد عينة لتشغيل SDS-PAGE. أضف كبريتات الأمونيوم إلى المادة الطافية حتى يتم الوصول إلى 30٪ من التشبع ، وحرك المحلول ، وتجنب الفقاعات. قم بالطرد المركزي للمحلول مرة أخرى لمدة 10 دقائق ، وانقل المادة الطافية إلى قارورة نظيفة لمزيد من الاستخدام.

أعد تعليق جزء الحبيبات الذي تم الحصول عليه برفق في 10 ملليلتر من المخزن المؤقت للعينة الثاني ، وقم بإعداد عينة لتشغيل SDS-PAGE. ثم قم بالطرد المركزي الدقيق لعينة البروتين بنسبة 40٪ عند 10 ، 000 مرة جم لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، وقم بتحميل المادة الطافية التي تم الحصول عليها على عمود HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR المتوازن مسبقا المتصل بأداة كروماتوغرافيا سائل بروتينية سريعة بمعدل تدفق 0.5 مل في الدقيقة. قم بتقييم كسور الذروة التي تم جمعها وكسور كبريتات الأمونيوم على هلام SDS-PAGE بنسبة 12٪ ملطخ باللون الأزرق اللامع Coomassie.

تركيز النوع البري أو المتحور ألفا اثنين بيتا اثنين السالمونيلا التيفيموريوم التربتوفان سينسيز مركب مع مرشح طرد مركزي 100 كيلودالتون عن طريق الدوران عند 3 ، 000 مرة ، عند أربع درجات مئوية. انقل البروتين المركز إلى أنبوب جديد سعة ملليلترين ، ومرة أخرى جهاز طرد مركزي عند 10 ، 000 مرة جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات لإزالة الركام. بعد تحديد تركيز البروتين للعينة ، قم بإعداد 0.5 ملليلتر من الحصص بمعدل 20 إلى 25 ملليغرام لكل ملليلتر.

بتجميدها في النيتروجين السائل ، وقم بتخزينها عند 80 درجة تحت الصفر. قم بإعداد محلول مخزون سعة خمسة ملليلتر من 200 ملليمولار من المنوية في الماء ، وقم بتخزينه في 500 ميكرولتر عند 20 درجة تحت الصفر. ثم قم بإعداد محلول مخزون سعة 50 مليلتر من 30٪ بولي إيثيلين جلايكول 8 ، 000 في الماء ، واحتفظ ب 25 مل في قارورة مخروطية الشكل لأجهزة الطرد المركزي سعة 50 مليلتر عند 25 درجة مئوية.

قم بإعداد محاليل مخزون سعة 25 مل من كلوريد السيزيوم أحادي المولار وكلوريد الصوديوم ، كل منهما في الماء ، واحتفظ بها عند 25 درجة مئوية. قم بإعداد ثلاث مجموعات من محاليل مخزون سعة 50 مليلتر من بائسين أحادي المولار ، وقم بمعايرته بهيدروكسيد السيزيوم أو هيدروكسيد الصوديوم للحصول على محاليل مخزنة عند درجة الحموضة 7.6 و 7.8 وثمانية. احتفظ بكميات 25 مليلتر من المحاليل عند أربع درجات مئوية.

قم بإذابة عينة من مركب ألفا دو بيتا اثنان السالمونيلا تيفيموريوم التربتوفان سينسيز في حمام جليدي. ثم قم بجهاز الطرد المركزي الدقيق عند 10 ، 000 مرة جم لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية. انقل الجزء الطافي الشفاف إلى أنبوب طرد مركزي نظيف.

قم بتقدير تركيز البروتين للمادة الطافية ، وقم بتخفيف الحصص إلى 15 ملليغرام لكل مليلتر باستخدام 50 ملليمولار من هيدروكسيد السيزيوم البيسيني أو هيدروكسيد الصوديوم البيسين بدرجة الحموضة 7.8 ، والتي تحتوي على 50 ملليمولار من السيزيوم أو كلوريد الصوديوم. قم بإعداد 500 ميكرولتر من محاليل الخزان لثلاث ألواح إسقاط ذات 24 بئرا في أنابيب معقمة للطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل. قم بتغيير تركيز PEG 8 ، 000 والسمبيرين ، وقم بتغيير درجة الحموضة العازلة كما هو موضح في المخطوطة النصية لكل مجموعة.

قم بتغطية الأنابيب ، وقم بدوامة بقوة لمدة 10 ثوان ، قبل طردها عند 10،000 مرة جم لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية لإزالة فقاعات الهواء. قم بتوزيع 500 ميكرولتر من هذا المحلول في كل خزان. قم بتوزيع خمسة ميكرولترات من محلول البروتين بمعدل 15 ميكروغراما لكل لتر في كل قطرة جلوس جيدا باستخدام ماصة دقيقة P-10.

ثم أضف خمسة ميكرولترات من كل محلول خزان مقابل إلى قطرة البروتين. تجنب فقاعات الهواء أثناء الخلط ، ولا تقم بسحب الماصة لأعلى ولأسفل. أخيرا ، قم بتغطية اللوحة بشريط لاصق شفاف ، وقم بتخزينها على حرارة 25 درجة.

تظهر البلورات في غضون يومين إلى خمسة أيام وتنمو إلى أبعادها الكاملة في غضون أسبوعين. تم استخدام هذا البروتوكول لاستنساخ الوحدة الفرعية ألفا والوحدة الفرعية بيتا من سينسيز السالمونيلا التيفيموريوم تريبتوفان في متجه pET SUMO المعدل. تظهر هنا نتائج SDS-PAGE التمثيلية لشريطين قويين يتوافقان مع بروتين اندماج سينسيز التربتوفان His6-SUMO-beta.

تم تنقية كل بروتين بواسطة كروماتوغرافيا تقارب حمض النيكل والنيتريلوترياتيك وترسيب كبريتات الأمونيوم ، متبوعا بانقسام علامة سومو ، وإزالة آثار علامة سومو الخاصة به ، وقياس تركيز البروتين. يظهر هنا ملف تعريف الشطف للوحدة الفرعية ألفا ، والوحدة الفرعية بيتا ، ومركب ألفا ثنائي بيتا اثنين من السالمونيلا تيفيموريوم التربتوفان سينسيز على SEC ، ونقاء كسور الذروة الخاصة بها. بعد توليد أشكال متحولة من مركب سينسيز التربتوفان ، تم استخدام تجزئة كبريتات الأمونيوم لإزالة البروتينات الملوثة من نظام التعبير غير المتجانس.

هنا ملف تعريف شطف تمثيلي مع موضع شطف نسبي لمركب ألفا بيتا اثنين من السالمونيلا التيفيموريوم تريبتوفان سينسيز على عمود كروماتوغرافيا الاستبعاد. تم تحليل نقاء كسور الذروة المستبعدة باستخدام SDS-PAGE قبل التجميع. تم الحصول على بلورات مفردة كبيرة من خلال تحسين التبلور الدقيق عن طريق تغيير تركيزات PEG 8 ، 000 وتركيزات المنوية ودرجة الحموضة العازلة للبيسين.

ظهرت البلورات ذات الأشكال المختلفة في غضون يومين إلى خمسة أيام ونمت إلى الحجم الكامل في غضون أسبوعين. تم توضيح التحقق من صحة خرائط كثافة الإلكترون للتركيب البلوري لمركب سينسيز السالمونيلا التيفيموريوم التربتوفان من النوع البري بعد صقل الهيكل البلوري. عند تنفيذ هذا البروتوكول ، أكمل خطوات التنقية الأولية في درجة حرارة الغرفة في أسرع وقت ممكن لمنع فقدان نشاط سينسيز التربتوفان.

من المتوقع أن توفر الهياكل البلورية للطفرات رؤى جديدة حول الآلية والأدوار التي تلعبها المخلفات الرئيسية في تخليق L-tryptophan.