الإدخال الانتقالي المشترك لبروتينات الغشاء في الأقراص النانوية سابقة التشكيل

البروتوكول عالي الكفاءة ومتعدد الاستخدامات. يمكن تطبيقه على أي بروتين غشائي تقريبا ، ويتم الانتهاء من إجراء الإنتاج بالكامل في غضون يوم واحد. ال يركب غشاء بروتينات يستطيع كنت استقرت سابقا [كو-ترنسلي] ب يزود رابطات.

يتم تجنب ملامسة المنظفات تماما ، ويتم إدخال البروتينات وطيها مباشرة في بيئات الأغشية المتوفرة والمخصصة. تعد الأساليب الهيكلية والتوصيف الوظيفي وتوليد الأجسام المضادة من المجالات الرئيسية للتطبيق. علاوة على ذلك ، فإن هذه التقنية واضحة في تحليل تأثيرات الدهون على طي البروتين الغشائي ووظيفته.

في اليوم الثالث من الثقافة ، قم بتلقيح 10 لترات من وسط YPTG المعقم بزاوية 37 درجة مئوية في مفاعل خزان مقلوب سعة 15 لترا مع 100 مل من ما قبل الزراعة. وزراعة البكتيريا عند 37 درجة مئوية مع 500 دورة في الدقيقة في التهوية العالية. لمنع الرغوة المفرطة ، أضف مضادا معقما مضادا للرغوة.

عندما تصل الخلايا إلى مرحلة منتصف السجل ، أضف 300 مل من الإيثانول إلى المزرعة واحتضان الخلايا عند 42 درجة مئوية مع 500 دورة في الدقيقة في تهوية عالية لمدة 45 دقيقة أخرى. في نهاية الحضانة ، قم بحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، واستخدم ملعقة وماصة لإعادة تعليق الخلايا تماما في 300 مل من المخزن المؤقت S30A. الطرد المركزي البكتيريا المعلقة مرتين ، وغسل الحبيبات ب 300 مل من S30A الطازج لكل غسلة.

بعد الغسيل الثاني ، أعد تعليق الخلايا في حجم 1.1 من المخزن المؤقت S30B. قم بتحميل التعليق في خلية ضغط بالضغط الفرنسي المبردة مسبقا وقم بتعطيل الخلايا بمقياس 1 ، 000 رطل لكل بوصة مربعة مرة واحدة. لإزالة أي مكونات غير مستقرة وتحرير mRNA من الريبوسومات ، اضبط المحللة على 0.4 مولي كلوريد الصوديوم واحتضان العينة لمدة 45 دقيقة في حمام مائي 42 درجة مئوية.

لتجميع الأقراص النانوية البروتينية للسقالة الغشائية ، امزج محلول MSP1E3D1 مع محلول الدهون وأضف DPC إلى التركيز النهائي بنسبة 0.1٪ اضبط التفاعل على الحجم النهائي المناسب وفقا للجدول واحتضان التفاعلات لمدة ساعة واحدة عند 21 درجة مئوية تحت التحريك اللطيف. في نهاية الحضانة ، قم بترطيب غشاء كاسيت غسيل الكلى مسبقا باستخدام عازلة لتكوين القرص واستخدم حقنة لتحميل خليط التجميع في الكاسيت. بعد ذلك ، قم بغسيل الكلى للتفاعل ضد ثلاثة أحجام سعة خمسة لترات من المخزن المؤقت لتكوين القرص لمدة 10 إلى 20 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع التحريك قبل نقل الخليط إلى وحدات مرشح الطرد المركزي المتوازن لتكوين القرص مع قطع الوزن الجزيئي 10 كيلودالتون.

ثم ركز التفاعل على 300 ميكرومولار على الأقل عن طريق الطرد المركزي باستخدام قارئ UV-Vis لقياس التركيز. لتحضير تفاعل خال من الخلايا بالتبادل المستمر بمقدار ثلاثة ملليلتر ، قم بموازنة غشاء كاسيت غسيل الكلى سعة ثلاثة ملليلتر في 100 ملليمولر ثلاثي الأسيتات. واستخدم حقنة لنقل خليط التفاعل إلى الكاسيت.

باستخدام حقنة، قم بإزالة الهواء الزائد من حجرة خليط التفاعل وضع الكاسيت في غرفة غسيل الكلى. املأ الغرفة ب 60 مل من خليط التغذية وضع الغطاء على الغرفة. بعد تثبيت الغطاء في مكانه ، احتضن الغرفة لمدة 12 إلى 16 ساعة عند 30 درجة مئوية في 200 دورة في الدقيقة.

لإعداد تفاعل خال من الخلايا لتبادل الخلايا سعة 60 ميكرولتر لفحص أيونات المغنيسيوم ، أضف 60 ميكرولترا من 3X Master Mix المحضر حديثا إلى خليط التفاعل و 825 ميكرولترا إلى خليط التغذية. واملأ خليط التغذية بالماء. بعد الدوامة ، أضف 825 ميكرولترا من خليط التغذية إلى كل من الآبار الثلاثة من صفيحة مجهرية مكونة من 24 بئرا.

قم بقطع أنابيب غسيل الكلى السليلوز المتجددة بقطع الوزن الجزيئي من 10 إلى 14 كيلو دالتون إلى قطع بحجم 25 × 20 ملم تقريبا ، وقم بتخزين القطع في الماء المكمل بنسبة 0.05٪ أزيد الصوديوم. قبل تجميع الحاوية الخالية من الخلايا لتبادل الخلايا الصغيرة ، استخدم منديلا لإزالة أي ماء زائد من أغشية غسيل الكلى ، وضع قطعة غشاء واحدة على كل حاوية. قم بتثبيت الأغشية بحلقة بولي تترافلورو إيثيلين وانقل الحاوية الصغيرة إلى بئر واحد من خليط التغذية.

أضف المكونات عالية الجزيئات إلى خليط التفاعل، كما هو موضح في الجدول، واخلطها عن طريق سحب العينات. أضف 60 ميكرولترا من خليط التفاعل إلى حاوية التفاعل ، مع الحرص على تجنب فقاعات الهواء. ولف لوحين بحجم ثمانية × 10 سنتيمترات من فيلم لدن بالحرارة مانع التسرب حول اللوحة المكونة من 24 بئرا.

ثبت غطاء لوحة البئر في مكانه بشريط لاصق وضع اللوحة عند 30 درجة مئوية في 200 دورة في الدقيقة مع التحريك لمدة 12 إلى 16 ساعة. في صباح اليوم التالي، استخدم طرف ماصة لاختراق غشاء غسيل الكلى في الحاوية الخالية من الخلايا لتبادل الخلايا الصغيرة وشفط خليط التفاعل. انقل خليط التفاعل إلى أنابيب طرد مركزي جديدة وأجهزة طرد مركزي لإزالة الرواسب.

ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. يظهر هنا تأثير تمثيلي لمركبات تفاعل الضبط الدقيق على العائد النهائي أو جودة بروتينات الغشاء المركبة. في هذا التحليل ، كان التوليف الكلي والذوبان النانوي للمستقبل الأدرينالي T-beta-one متشابها تحت جميع تركيبات الغشاء التي تم تحليلها.

في المقابل ، تم الكشف عن تباين أعلى بكثير في جودة المستقبلات المقترنة ببروتين G المركب ، مع أقل نشاط تم الحصول عليه باستخدام دهون DMPC و POPC ، وأعلى لوحظ عند تطبيق DOPG و POPG. مجتمعة ، تشير هذه النتائج إلى أن شحنة مجموعة رأس الدهون بالإضافة إلى مرونة سلسلة الأحماض الدهنية هي معدلات مهمة لطي ونشاط بروتين غشاء الخلية. يمكن أن يكون تركيز القرص النانوي النهائي أيضا عاملا مهما لجودة بروتين الغشاء.

على سبيل المثال ، إذا تم فحص تركيز القرص النانوي في نطاق من 3.75 إلى 60 ميكرومولار ، يتم الحصول على إذابة كاملة للمستقبل المقترن ببروتين G عند ما يقرب من 30 ميكرومولار أقراص نانوية ، مما يعطي نسبة بروتين غشاء واحد إلى ثلاثة إلى قرص نانوي. في المقابل ، يمكن تحقيق الذوبان الكامل للبروتيورهودوبسين باستخدام ما يقرب من 10 أقراص نانوية ميكرومولار ، مما يعطي نسبة 10 إلى واحد من البروتيورهودوبسين إلى القرص النانوي. من المؤكد أن سحب العينات الدقيق والمكونات عالية الجودة إلزامية.

الخطوات الحاسمة لتحضير المحللات هي حصاد الخلايا في منتصف مرحلة السجل وتطبيق خطوة عالية الملح. تقلل هذه التقنية بشكل كبير من تعقيد تخليق البروتين الغشائي يتم تصنيع الأهداف الصعبة سابقا بكفاءة ، مما يسمح بالعمل على الهياكل الجزيئية للبروتينات ذات الصلة الصيدلانية غير المستكشفة حتى الآن.