Name: إلغاء التفكيك لمجمع مورين لأمراض القلب والعقد (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: اكتشف بروتوكول إلغاء التفكيك لإنشاء هياكل مصفوفة خارج الخلية من قلب وفئران رئوية مع الحفاظ على السلامة البنيوية. تتيح هذه الطريقة التحليل الكيميائي الحيوي والتشريحي بدقة دون ميكرونية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر البروفيسور إيفانا نوفاك والدكتورة نين مين كريستنسن (مركز التصوير الحيوي المتقدم (CAB)، جامعة كوبنهاغن) على توفير الوصول إلى المجهر. وقد دعم هذا العمل مجلس البحوث الأوروبي (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN؛ AEM-G، OW، RR و JTE)؛ منحة دكتوراه من مؤسسة لوندبيك (R286-2018-621؛ MR)؛ مجلس البحوث السويدي (2017-03389؛ آلية التنمية النظيفة)؛ الجمعية السويدية للسرطان، Cancerfonden (CAN 2016/783، 19 0632 Pj، 190007؛ آلية التنمية النظيفة)؛ المعونة الألمانية لمكافحة السرطان (دويتشه كريبشيلفي؛ RR)؛ وجمعية السرطان الدنماركية (R204-A12454; RR).

وقد تم استعراض جميع الإجراءات المدرجة هنا والموافقة عليها من قبل اللجنة الأخلاقية التي تنظم الطب التجريبي في جامعة كوبنهاغن وتتفق مع التشريعات الدنماركية والأوروبية. لإثبات هذا البروتوكول ، استخدمنا فئران BALB / cJ الأنثوية من عمر 8-12 أسبوعا وفأرة أنثى MMTV-PyMT تبلغ من العمر 11 أسبوعا.
ملاحظة: تجنب التلوث البكتيري سقالة ECM decellularized يعطي أفضل نتيجة التصوير ويسمح تخزين عينة على المدى الطويل. ولذلك فمن المهم للحفاظ على جميع الخطوات عقيمة. على هذا النحو، يجب أن تكون جميع الأدوات والمواد الجراحية، بما في ذلك خياطة، خياطة صغيرة، والحلول، والأنابيب، موصلات لوير والقسطرة، عقيمة. يجب تطهير الأسطح ، بما في ذلك صينية البوليسترين ، بالإيثانول بنسبة 70٪ ، ويفضل أن يتم التشوه تحت غطاء تدفق صفح. جميع الإجراءات تتم في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك.
1. الجراحة المجهرية بعد الوفاة
<ol><li>قتل الفأر باستخدام غرفة ثاني أكسيد الكربون.<ol>
<li>ضع الماوس في غرفة 4 لتر، وابدأ في ملء مع CO2 100٪، بدءا من 0.2 لتر / دقيقة لمدة 2 دقيقة، وزيادة حتى تصل إلى تدفق 0.8 لتر / دقيقة بعد 3 دقائق. يجب أن يسقط الماوس فاقدا للوعي خلال أول دقيقتين ، ثم يجب أن يتوقف التنفس (عادة حوالي 5 دقائق ، ولكن يمكن الحفاظ على التدفق حسب الضرورة). تأكيد الوفاة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>حلق الصدر والبطن وظهر الماوس مع مقص الشعر وتطهير مع الإيثانول 70٪. الحلاقة يقلل كثيرا من عدد القطع الأثرية بسبب وجود الشعر إما على عينات للتصوير أو التحليل الكيميائي الحيوي.</li>
	<li>دبوس الماوس إلى صينية البوليسترين، وتمديد المصابيح الأمامية و hindlimbs، فضلا عن رأسه والذيل. ضعه تحت مجهر الجراحة المجهرية.</li>
	<li>باستخدام مقص نمط مستقيم مايو إنشاء الوصول الجراحي مع شق جلدي يمتد من المنطقة تحت الفك السفلي إلى أسفل البطن وتشريح تحت الجلد لفضح جدار الصدر والحمور.</li>
	<li>باستخدام مقص جراحي دقيق، وقطع العضلات الصدرية الرئيسية والصدرية طفيفة على طول الفضاء الوربي السادس على جانبي الجدار الصدري.</li>
	<li>باستخدام مقص نمط مستقيم، وقطع القص على طول الشقوق السابقة، ومن ثم إكمال استئصال القص عن طريق قطع القص على طول محورها الطويل، ثم رفع ودبوس كلا الجانبين من الجدار الصدري لفضح مجمع القلب والعظمة.</li>
	<li>باستخدام ملقط صغير مستدير الرؤوس (أو ملقط صغير من Dumont) ، اقتطع الغدة الصعترية والأنسجة الدهنية المحيطة بها عن طريق سحبها بدقة من ملحقاتها. هذا سيكشف عن السفن الرئيسية.</li>
	<li>باستخدام الكي، الكي الوريد كافا تنازلي و، وذلك باستخدام مقص نمط مستقيم، وقطع المريء.</li>
	<li>باستخدام ملقط صغير حاد ، افصل الأوردة البراتشيوسيفية والبراتشيوسيفال ، وترك الشرايين السباتية الشائعة واليسارية من الأنسجة الأساسية لتسهيل الربط والكي.</li>
	<li>باستخدام حامل الإبرة الدقيقة ، ملقط صغير حاد و 9-0 غرز خياطة مكان فوق ظهور brachiocephalic ، تركت الشرايين السباتية الشائعة واليسارية تحت الترقوة.</li>
	<li>كي الأوردة العضدية.</li>
	<li>فصل الغدد اللعابية تحت الفك السفلي على طول خط الوسط لفضح عضلات الرقبة والرغامى. فصل العضلات لفضح الرباط الكريكوثيرويد. باستخدام مقص صغير، افتح مدخلا عن طريق تقسيم الرباط.</li>
	<li>إدخال قسطرة 27 G في القصبة الهوائية ودفع بدقة حتى فروع القصبة الهوائية في القصبات الهوائية (أي، حتى يتم الوفاء بمقاومة القسطرة، ثم تراجع 3 ملم). كن حذرا من تعطيل الشعب الهوائية. باستخدام خياطة 6-0، ضع 3 غرز حول القصبة الهوائية لتأمين القسطرة.</li>
	<li>قسم الماوس في ذروة الفقرة الصدرية 12th. الشريان الأورطي التنازلي يمتد بشكل مسبق إلى العمود الفقري وينبغي تقسيمه هنا جنبا إلى جنب مع العمود الفقري. تعيين النصف السفلي بعيدا.</li>
	<li>القسطرة إلى الوراء الشريان الأورطي ودفع القسطرة حتى تصل إلى القوس الأبهري. باستخدام خياطة 9-0، ضع 4 غرز حول الشريان الأورطي، بداية من 5 مم تحت طرف القسطرة.</li>
</ol>2. التفكيك
<ol><li>قم بتوصيل الماوس بنظام مضخة باستخدام أنابيب السيليكون وموصلات Luer. Perfuse مع الماء deionized في 200 ميكرولتر / دقيقة لمدة 15 دقيقة. الاحتفاظ بمعدل التدفق هذا أثناء التفكيك.</li>
	<li>تغيير عامل التغلغل إلى 0.5٪ ديوكسيكولات الصوديوم (DOC) المخفف في الماء deionized وتغلغل بين عشية وضحاها.</li>
	<li>تغيير عامل التشوه إلى 0.1٪ من كبريتات دودسيل الصوديوم (SDS) المخفف في الماء التأين والتشويش لمدة 8 ساعات.</li>
	<li>Perfuse مع المياه deionized بين عشية وضحاها لغسل SDS وDOC لمدة 24 ساعة.</li>
	<li>إعادة استئصال القلب والرئتين decellularized عن طريق تقسيم ملحقاتها إلى الصدر باستخدام مقص منحني وتخزينها في أنبوب التبريد العقيم مع الماء deionized مع 1٪ (v/v) البنسلين-streptomycin و 0.3 ميكرومتر الصوديوم azide في 4 درجة مئوية يمكن تخزين سقالات ECM لمدة 12 أسبوعا على الأقل. إذا كان سيتم استخدام السقالة للتحليل الكيميائي الحيوي (على سبيل المثال، قياس الطيف الكتلي)، تجميد المفاجئة في النيتروجين السائل.</li>
</ol>3. التثبيط المناعي
<ol><li>تخطيط التصوير: تحديد الأجسام المضادة الأولية (أو الأجسام المضادة) والجمع بين الأجسام المضادة الثانوية المترافقة الفلورية لتتناسب مع بعضها البعض وتتناسب مع خطوط الليزر من المجهر الفلوري.</li>
	<li>منع العينة عن طريق غمرها في cryotube تحتوي على 6٪ (v/v) مصل حمار - 3٪ (ث / v) ألبوم مصل البقر (BSA) بين عشية وضحاها.</li>
	<li>احتضان مع الأجسام المضادة الأولية (أو الأجسام المضادة) في مصل الحمير 3٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 24 ساعة.</li>
	<li>غسل 5 مرات لمدة 1 ساعة في كل مرة في 0.05٪ توين 20 في برنامج تلفزيوني (PBST).</li>
	<li>احتضان العينة مع الأجسام المضادة الثانوية المقترنة الفلورية (أو الأجسام المضادة) في مصل حمار 3٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 24 ساعة.</li>
	<li>غسل 5 مرات لمدة ساعة واحدة في 0.05٪ (PBST). انتظر 1 ساعة بين كل غسل.</li>
	<li>أضف الماء المؤين واحفظه على بعد 4 درجات مئوية من الضوء المباشر. عند هذه النقطة ، سقالة على استعداد للصورة.</li>
</ol>4. التصوير
<ol><li>ضع العينة في طبق ذو قاع زجاجي وترطيبها بقطرات من محلول التخزين (PBS أو الماء المؤين).</li>
	<li>إعداد الهدف. نوصي باستخدام هدف غمر المياه.</li>
	<li>فحص العينة باستخدام ضوء مضان.</li>
	<li>التبديل إلى التحكم في الكمبيوتر. قم بتشغيل الليزر وضبط كثافة الليزر وفتحة الثقب والأطوال الموجية للكاشفات والكسب والدقة والتكبير. تعيين رقم وحجم الخطوة ل z-المكدس وبدء الاستحواذ. نوصي باستخدام الإثارة بالليزر متعددة الفوتون لزيادة اختراق الأنسجة وتقليل تشتت الضوء والتبييض وتلف الأنسجة.</li>
</ol>5. تلطيخ هيماتوكسيلين إيوزين
<ol><li>استئصال 1 فص الرئة من فأر القتل الرحيم.</li>
	<li>ضعه في 10 مم × 10 مم × 5 مم كريومولد وغطيه بما يقرب من 500 ميكرولتر من مركب OCT.</li>
	<li>تجميد على الجليد الجاف (-70 درجة مئوية) والحفاظ على العينة في تلك الدرجة حرارة.</li>
	<li>استئصال واحد فص الرئة decellularized من الماوس المعالجة وفقا للخطوة 2.5.</li>
	<li>ضعه في cryomold مع أكبر مساحة سطحية لأسفل وغطيه بمجمع OCT كما هو محدد في الخطوة 5.2.</li>
	<li>تجميد على الجليد الجاف (-70 درجة مئوية) والحفاظ على العينة في تلك الدرجة الحرارة حتى المطلوبة خلاف ذلك. يمكن تخزين العينة لمدة 12 أسبوعا على الأقل.</li>
	<li>كتل الأنسجة المجمدة القسم في -20 درجة مئوية في cryostat مع سمك 5 ميكرومتر ووضع أقسام على الشرائح الزجاجية اللاصقة وتخزينها في -80 درجة مئوية.</li>
	<li>خذ الشرائح إلى درجة حرارة الغرفة حتى يجف الهواء (حوالي 20 دقيقة).</li>
	<li>تزج قريبا في برنامج تلفزيوني وإصلاح عن طريق غمر الشرائح في 4٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة. يغسل مرة واحدة في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، ثم مرتين في الماء المقطر لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>تزج في محلول الهيماتوكسيلين ماير لمدة 10 دقيقة. هذه المرة يمكن تحسين وفقا لمصدر الأنسجة وإعداد وصمة عار.</li>
	<li>يغسل في جرة كوبلين تحت الماء المقطر الجاري لمدة 10 دقائق.</li>
	<li>تزج في حل إيوسين لمدة 7 دقائق. هذه المرة يمكن تحسين وفقا لمصدر الأنسجة وإعداد وصمة عار.</li>
	<li>تراجع في الإيثانول 50٪ لإزالة اليوسين الزائد والجفاف عن طريق الانخفاض قريبا في الإيثانول 70٪، وفي 96٪ و 100٪ الإيثانول لمدة 30 ثانية. تراجع في الزيلين عدة مرات.</li>
	<li>تطبيق بضع قطرات من DPX تصاعد المتوسطة ووضع غطاء الزجاج.</li>
	<li>اترك الشرائح لتجف بين عشية وضحاها تحت غطاء محرك السيارة الكيميائي.</li>
	<li>مسح الشرائح ضوئيا في ماسح ضوئي للشرائح.</li>
</ol>

<ol><li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix%3A+not+just+pretty+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326, 1216-1219 (2009).</li>
<li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISDoT%3A+in+situ+decellularization+of+tissues+for+high-resolution+imaging+and+proteomic+analysis+of+native+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix.</a> Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).</li>
<li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).</li>
<li>White, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+detergents+on+the+tissue+decellularization+process%3A+A+TOF-sims+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study.</a> Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+re-engineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Wershof, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FIJI+Macro+for+quantifying+pattern+in+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix.</a> BioRxiv. , (2019).</li>
</ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

تقنيات إزالة الخلايا على أساس هياج الأنسجة تغيير هيكل ECM، مما يجعلها غير مناسبة لتحليل هيكل ECM4. الارتهاق الارتخائي ، باستخدام مسار تشريحي مثل الشريان الأورطي للرغامى ، يسمح بالوصول إلى السرير الشعري ، أو الحويصلات الهوائية الطرفية ، ويسهل تسليم عوامل التفكيك في جميع أنحاء الجهاز. استخدام المنظفات zwitterionic، أنيوني وغير أيونية لdeellularize الأنسجة هو المبلغ عنها4،5،6، ومع ذلك، الصوديوم دودسيل كبريتا...

و ECM هي شبكة ثلاثية الأبعاد مصنوعة من البروتينات والجلوكان التي تستوعب جميع الخلايا في كائن متعدد الخلايا، وإعطاء الأعضاء شكلها وتنظيم سلوك الخلية طوال الحياة1. من تخصيب البويضة فصاعدا، تقوم الخلايا ببناء وإعادة تشكيل ECM، وبالتالي يتم التحكم فيها بدقة من قبلها. الغرض من هذا البروتوكول هو فتح طريقة لتحليل خريطة الفأر ECM ، حيث أن الفئران هي الكائن الحي النموذجي الأكثر استخداما في الفيزيولوجيا المرضية للثدييات.
وكان الدافع وراء تطوير هذه الطريقة هو الحاجة إلى توصيف وعزل ECM2 الأصلي المرتبط بالنقائل. نظرا لأن الأورام تفتقر إلى الأوعية الدموية التشريحية المناسبة والفئران هي كائنات صغيرة نسبيا ، فقد تم تصميم الإجراءات الجراحية الدقيقة لقسطرة الشريان الأورطي إلى الوراء ، مع عزل دوران الأوعية الرئيسية المؤدية إلى الورم (على سبيل المثال ، الأوردة الرئوية) ، وبالتالي تركيز تدفق الكاشف والسماح بإزالة الورم. تنتج هذه الطريقة سقالات ECM مع هيكل محفوظ2 يمكن أن يكون ملطخا بالمناعة ومصورا ، مما يسمح برسم خرائط بنية ECM بتفاصيل submicron. لتنفيذ هذا البروتوكول، من الضروري اكتساب المهارات الجراحية والجراحية الدقيقة (تشريح، والتسوية الدقيقة والقسطرة) التي قد تمثل قيدا محتملا على استخدامه. على حد علمنا، تمثل هذه الطريقة أحدث ما في تحليل تصوير بنية ECM الأصلي2,3.

<table><tbody><tr><td>خياطة <قوية > جراحة مجهرية < / قوية ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>6-0 ، إبرة مقطع مثلثة (فيكريل)</td> <td>إيثيكون</td><td>6301124</td><td></td></tr><tr><td>9-0 خياطة دقيقة (سافيل)</td> <td>بي براون</td><td>G1048611</td><td></td></tr><tr><td>ملقط أدسون</td><td>أدوات العلوم الدقيقة</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>ملقط أدسون بالأسنان</td><td>أدوات العلوم الدقيقة</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>حامل الإبرة الدقيقة Castroviejo</td><td>أدوات العلوم الدقيقة</td><td>رقم 12061-01</td><td></td></tr><tr><td>CO2 غرفة تهوية للقتل الرحيم للفأر</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>الماء منزوع الأيونات (Milli-Q IQ 7000 ، نظام مياه المختبر فائق النقاء)&nbsp;</td><td>علبة البوليسترين القابل للتصرف Merck</td><td>ZIQ7000T0</td><td></td></tr><tr><td>(~ 30 مرات ؛ 50 سم)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>مجهر التشريح (Greenough ، مع ذراعين معقوفين)</td><td>Leica</td><td>S6 D</td><td></td></tr><tr><td>ملعقة صغيرة مزدوجة النهايات</td><td>أدوات العلوم الدقيقة</td><td>10091-12</td><td></td></tr><tr><td>ملقط دومون (اثنان)</td><td>أدوات العلوم الدقيقة</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>ملقط دومون الدقيق مع 45 درجة ؛ نصائح (اثنان)</td><td>أدوات العلوم الدقيقة</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>ماكينة قص الشعر</td><td>Oster</td><td>76998-320-051</td><td></td></tr><tr><td>حامل إبرة Halsey (مع فكوك كربيد التنجستن)</td><td>أدوات العلوم الدقيقة</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>قسطرة قياس 24 في الوريد (Insyte)</td><td>BD</td><td>381512</td><td></td></tr><tr><td>قسطرة قياس 26 في الوريد (Terumo)</td><td>Surflo-W</td><td>SR +DM2619WX</td><td></td></tr><tr><td>مقص مايو (قطع قوي ، مستقيم)</td><td>أدوات العلوم الدقيقة</td><td>14110-15</td><td></td></tr><tr><td>ملقط دقيق بأطراف حلقية (اثنان)</td><td>مقص زنبركي صغير Aesculap</td><td>FM571R</td><td></td></tr><tr><td>(Vannas ، منحني)</td><td>أدوات العلوم الدقيقة</td><td>15001-08</td><td></td></tr><tr><td>Minicutter</td><td>KLS Martin</td><td>80-008-03-04</td><td></td></tr><tr><td>Molt Periostotome</td><td>Aesculap</td><td>D0543R</td><td></td></tr><tr><td>الإبر (مقياس 27 ؛ Microlance)</td> <td>د.ب</td><td>21018</td><td></td></tr><tr><td>منشفة ورقية (معقمة) أو منديل جراحي&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>مقص مسنن (CeramaCut ، مستقيم)</td><td>أدوات العلوم الدقيقة</td><td>14958-09</td><td></td></tr><tr><td>ملعقة (Freer-Yasargil)</td>محاقن <td>Aesculap</td><td>OL166R</td><td></td></tr><tr><td>(1 مل ؛ Plastipak)</td><td>BD</td><td>3021001</td><td></td></tr><tr><td>المحاقن (10 مل ؛ Plastipak)</td> <td>BD</td><td>3021110</td><td></td></tr><tr><td>مقص الوتر (والتون)</td> <td>أدوات العلوم الدقيقة</td><td>14077-09</td><td></td></tr><tr><td><قوي> IMMUNOSTAINING</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 حمار مضاد لخنزير غينيا IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 حمار مضاد للأرانب IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>BSA (جزء الألبومين البقري V ، الصف القياسي ، المجفف بالتجميد ) &nbsp ؛</td><td>Serva</td><td>11930.03</td><td></td></tr><tr><td>الكولاجين IV الأجسام المضادة متعددة النسيلة (RRID: AB_2276457)&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>AB756P</td><td>المضيف: أرنب</td></tr><tr><td>PBS (درجة الحموضة 7.4 ، 10 مرات ؛ Gibco) &nbsp ؛</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011044</td><td>Host: الماعز</td></tr><tr><td>بيريوستين الجسم المضاد متعدد النسيلة (هدية لطيفة من مانويل كوخ. RRID: AB2801621)</td><td></td><td></td> <td>المضيف: خنزير غينيا</td></tr><tr><td>مشرط يمكن التخلص منه بشفرة رقم 11 (قطعة. 10)</td> <td>VWR</td><td>233-5364) مصل</td><td></td></tr> <tr><td>(مصل حمار عادي) &nbsp ؛</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><<tr><td>strong>IMAGING</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; أجهزة الكشف (كاشف هجين (Leica ، نموذج HyD S) وأنابيب المضاعف الضوئي (PMTs)&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; مصدر ضوء الفلورة&nbsp;</td><td>لايكا</td><td>EL6000</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; المجهر (المجهر متعدد الفوتون المقلوب) &nbsp;</td><td>Leica</td><td>SP5-X MP</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; الهدف (لامدا الأزرق ، 20 مرة؛ ، 0.70 فتحة عددية (NA) IMM Uف) &nbsp ؛</td><td>Leica</td><td>HCX PL APO</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; ثنائي الفوتون Ti & ndash ؛ ليزر الياقوت (فيزياء الأطياف ، نموذج ماي تاي ديب سي)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; ليزر الضوء الأبيض (WLL) &nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td><قوي>إزالة الخلايا < / قوي ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>70٪ إيثانول (الكحول المطلق 99.9٪) ؛ يجب تعديل الكحول المطلق إلى 70٪ (حجم / حجم) باستخدام الماء منزوع الأيونات &nbsp ؛</td>ماء <td>البرقوق</td><td>1680766</td><td></td></tr><tr><td>منزوع الأيونات (Milli-Q IQ 7000 ، نظام مياه المختبر عالي النقاء) &nbsp;</td><td>تجهيزات الذكور</td><td>Merck ZIQ7000T0</td><td></td></tr><tr><td>Luer-to-tubing (1/8 بوصة)</td><td>World Precision Instruments</td><td>13158-100</td><td></td></tr><tr><td>PBS (درجة الحموضة 7.4 ، 10 مرات ؛ Gibco) &nbsp ؛</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>البنسلين والستربتومايسين</td><td>جيبكو</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>مضخة التمعج (مع 12 قناة) أنابيب</td> سيليكون <td>Ole Dich</td><td>110AC (R) 20G75</td><td></td></tr><tr><td>(مع معرف 2 مم و 4 مم OD)</td><td>Ole Dich</td><td>31399</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>08591-1ML-F</td><td></td></tr><tr><td>deoxycholate الصوديوم (DOC)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>كبريتات دوديسيل الصوديوم</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>L3771-500G</td><td></td></tr><tr><td>H& E STAINING< / قوي ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4٪ PFA</td><td>فيشر Scientific</td><td>15434389</td><td></td></tr><tr><td>96٪ إيثانول</td><td>برقوق</td><td>201446-5L</td><td></td></tr><tr><td>الإيثانول المطلق</td><td>البرقوق</td><td>201152-1L</td><td></td></tr><tr><td>أغطية (24 × 50 مم ؛ 1000 قطعة)</td> <td>Hounisen</td><td>422.245</td><td></td></tr><tr><td>Cryomolds متوسط (15 × 15 × 5 مم ؛ 100 قطعة)</td> <td>Tissue-Tek</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td></td></tr><tr><td>DPX تصاعد متوسط</td><td>Hounisen</td><td>1001.0025</td><td></td></tr><tr><td>محلول Eosin Y كحولي 0.5٪</td> <td>Sigma</td><td>1024390500</td><td></td></tr><tr><td>شفرة ريشة ميكروتوم من الفولاذ المقاوم للصدأ ، C35 (50 قطعة)</td> <td>Pfm الطبية</td><td>207500003</td><td></td></tr> <tr><td> شرائح Fisherbrand Superfrost Plus (25 × 75 مم ؛ 144 قطعة)</td> <td>Thermofisher</td><td>6319483</td><td></td></tr><tr><td>مايرز هيماتوكسيلين</td><td>سيجما</td><td>MHS32-1L</td><td></td></tr><tr><td>OCT مركب</td><td>VWR</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>ماسح ضوئي للشرائح (نانوزومر)</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma</td><td>534056-4L</td><td></td></tr></tbody></table>

إلغاء التفكيك لمجمع مورين لأمراض القلب والعقد

Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex

نقدم هنا بروتوكول التفكيك لقلب الفأر والرئتين. وتنتج سقالات ECM الهيكلية التي يمكن استخدامها لتحليل طوبولوجيا ECM وتكوينها. وهو يقوم على إجراء جراحي دقيق مصمم لقسطرة القصبة الهوائية والأورطة من فأر القتل الرحيم لتشويش القلب والرئتين مع عوامل التفكيك. يمكن أن يكون مجمع القلب الرئوي الديسيلي في وقت لاحق ملطخا بالمناعة للكشف عن موقع بروتينات ECM الهيكلية. يمكن الانتهاء من الإجراء بأكمله في 4 أيام.
سقالات ECM الناتجة عن هذا البروتوكول خالية من التشوهات الأبعاد. غياب الخلايا يتيح الفحص الهيكلي للهياكل ECM وصولا الى قرار submicron في 3D. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على الأنسجة السليمة والمرضية من الفئران التي لا تتجاوز أعمارهم 4 أسابيع ، بما في ذلك نماذج الماوس من التليف والسرطان ، مما يفتح الطريق لتحديد إعادة عرض ECM المرتبطة بمرض القلب والكون.

الديسيلولارات القلبية الرئوية بعد الانتهاء بنجاح من البروتوكول، والقلب والرئتين، فضلا عن الأنسجة الملحقة مثل القوس الأبهري، وسوف تكون خالية من الخلايا. يمكن التحقق من صحة Decellularization عن طريق تلطيخ hematoxylin-eosin (الشكل 1) من سقالات ECM التي تظهر إزالة النواة مقارنة بالأنسجة الأصلية. تحتفظ هذه السقالات بأبعاد الأعضاء الطازجة وهيكل ECM غير القابل للذوبان سليم2. يظهر الشكل 2 تمثيل...

يهدف هذا البروتوكول إلى تداعي قلب ورئتي الفئران. يمكن أن تكون سقالات المصفوفة خارج الخلية الناتجة (ECM) ملطخة بالمناعة ومصورة لرسم خريطة لموقع وتضاريم مكوناتها.

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and ...

هذا البروتوكول هو بوابة المصفوفة خارج الخلية. انها التعقيد وهيكلها وصولا الى نطاق دون ميكرون. وبالتالي فإن الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنه يجعل من الممكن الحصول على مصفوفة خارج الخلية التي تحتفظ بسلامتها الهيكلية وبالتالي فتح الطريق للتحليل الكيميائي الحيوي والتشريحي.وسيكون من بين التدليل على الإجراء، أليخاندرو مايوركا جيلاني، ورافائيل توتن، وماريا رافايفا، الموجودون حاليا في مختبري وكريس مادسن، والذي كان في مختبري وواصل العمل في جامعة لوند. ابدأ بحلق الصدر والبطن وظهر الماوس القتل الرحيم بمقص شعر. تطهير المنطقة مع 70٪ الإيثانول.ثم دبوس الماوس إلى صينية البوليسترين، وتمديد أطرافه الخلفية نهاية أربعة، فضلا عن رأسه والذيل. ضعه تحت مجهر الجراحة المجهرية. باستخدام مقص نمط مستقيم مايو، وجعل شق جلدي يمتد من المنطقة السفلية الفك السفلي إلى أسفل البطن وتشريح تحت الجلد لفضح جدار الصدر والحمور.ثم استخدم مقص الجراحة الدقيقة لقطع العضلات الصدرية الرئيسية والصدرية البسيطة على طول المساحة الوربية السادسة على جانبي الجدار الصدري. قطع القص على طول الشقوق السابقة مع مقص نمط مستقيم. ثم إكمال استئصال القص عن طريق قطع القص على طول محورها الطويل.رفع ودبوس، كلا الجانبين من الجدار الصدري لفضح مجمع القلب والعقدة الرئوية. استخدام ملقط صغير مستدير يميل لاستئصال الغدة الصعترية والأنسجة الدهنية المحيطة بها عن طريق سحب بدقة لهم قبالة المرفقات الخاصة بهم. وقطع المريء بمقص صغير.فصل الأوردة brachiocephalic والشريان العضدي مع ملقط صغير حاد. ثم فصل السباتية الشائعة اليسرى والشرايين تحت الترقوة اليسرى من الأنسجة الأساسية لتسهيل الربط والكي. استخدام حامل microneedle والملقط الدقيق الحاد وتسعة يا خياطة لوضع غرز فوق ظهور brachiocephalic اليسار السباتية المشتركة والشرايين تحت الترقوة اليسرى، الكي الأوردة brachiocephalic.باستخدام مقص صغير، افتح مدخلا عن طريق تقسيم الرباط. إدخال قسطرة قياس 27 في القصبة الهوائية ودفع بدقة حتى فروع القصبة الهوائية في القصبات الهوائية، مع الحرص على عدم تعطيل القصبات الهوائية. باستخدام ستة خياطة O، ضع ثلاث غرز حول القصبة الهوائية لتأمين القسطرة.قسم الماوس في ذروة الفقرة الصدرية 12th ، الشريان الأورطي التنازلي يمتد من قبل إلى العمود الفقري ، وينبغي تقسيم هنا جنبا إلى جنب مع العمود الفقري. القسطرة إلى الوراء الشريان الأورطي ودفع القسطرة حتى تصل إلى القوس الأبهري. باستخدام خياطة، ضع أربع غرز حول الشريان الأورطي، بداية من خمسة ملليمترات تحت طرف القسطرة.قم بتوصيل الماوس بنظام مضخة باستخدام أنابيب السيليكون والموصلات السفلية. Perfuse مع الماء deionized في 200 ميكرولتر في الدقيقة الواحدة لمدة 15 دقيقة. ثم تغيير عامل التشوه إلى 0.5٪ DOC، مخففة في الماء deionized وتغلغل بين عشية وضحاها.في اليوم التالي، تغيير عامل التشوه إلى 0.1٪ SDS المخفف في الماء deionized، و perfuse لمدة ثماني ساعات. ثم perfuse مع الماء deionized لمدة 24 ساعة لغسل SDS وDOC. إعادة استئصال القلب والرئتين decellularized عن طريق تقسيم ملحقاتها إلى الصدر.تخزين الأنسجة في أنبوب التبريد العقيم في الماء deionized مع 1٪ ستريبتوميسين البنسلين و 0.3 ميكرومولار الصوديوم azide في أربع درجات مئوية. لإجراء تلطيخ المناعة، قم بحجب العينة عن طريق احتضانها في أنبوب التبريد الذي يحتوي على مصل حمار بنسبة 6٪ و3٪ BSA بين عشية وضحاها. ثم احتضان مع الأجسام المضادة الأولية في مصل حمار 3٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 24 ساعة.بعد الحضانة غسل العينة خمس مرات في PBST لمدة ساعة واحدة لكل غسل. احتضان العينة مع الأجسام المضادة الثانوية المقترنة الفلورية في مصل حمار 3٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 24 ساعة. ثم كرر يغسل في PBST.أضف الماء المؤين وخزن العينة على بعد أربع درجات مئوية من الضوء المباشر. لتصوير العينة، ضعها في طبق زجاجي أسفل وترطيبها برذاذين من محلول التخزين. حدد الهدف وافحص العينة باستخدام ضوء الفلورسينس.التبديل إلى التحكم في الكمبيوتر، وتشغيل أشعة الليزر وضبط كثافة الليزر، فتحة الثقب، والكاشفات الطول الموجي، وكسب، والقرار والتكبير. تعيين رقم وحجم الخطوة مكدس Z، ثم ابدأ اقتناء. استئصال فص الرئة واحد من فأر القتل الرحيم ووضعه في 10 في 10 في خمسة ملليمتر قالب التبريد.تغطية ذلك مع ما يقرب من 500 ميل ميكرولتر من مركب أكتوبر وتجميده على الجليد الجاف. حافظ على العينة عند درجة الحرارة تلك. استئصال واحد فص الرئة decellularized من الماوس المعالجة، ووضعه في قالب التبريد مع أكبر مساحة السطح إلى أسفل وتغطيتها مع مركب أكتوبر.تجميد العينة على الجليد الجاف والحفاظ عليها في درجة الحرارة تلك حتى المطلوبة خلاف ذلك. يمكن تخزين العينة لمدة 12 أسبوعا على الأقل. استخدام cryostat إلى قسم كتل الأنسجة المجمدة في خمسة أقسام ميكرومتر في ناقص 20 درجة مئوية.ووضع المقاطع على الشرائح الزجاجية اللاصقة. نقل الشرائح إلى درجة حرارة الغرفة حتى يجف الهواء. تزج لفترة وجيزة الشرائح في برنامج تلفزيوني، تليها 4٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة.يغسل مرة واحدة في برنامج تلفزيوني، ثم مرتين في الماء المقطر لمدة خمس دقائق لكل غسل. تزج الشرائح في محلول الهيماتوكسيلين ماير لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، اغسل الشرائح في جرة كوبلاند تحت الماء المقطر الجاري لمدة 10 دقائق وانغمس في محلول eosin لمدة سبع دقائق.تراجع في الزيلين عدة مرات. تطبيق بضع قطرات من DPX تصاعد المتوسطة ووضع زلة غطاء زجاجي. اترك الشرائح لتجف بين عشية وضحاها تحت غطاء محرك السيارة الكيميائي ثم قم بمسحها ضوئيا في ماسح ضوئي للشرائح.بعد الانتهاء بنجاح من البروتوكول، والقلب والرئتين والأنسجة NX تكون خالية من الخلايا. يمكن التحقق من صحة إزالة الخلايا عن طريق تلطيخ الهيماتوكسيلين إيوزين من سقالات ECM. تحتفظ السقالات بأبعاد الأعضاء الطازجة وهيكل ECM القابل للانزيم سليم.وأظهرت سقالات ECM زيادة نفاذية و penetrability الخفيفة. باستخدام هذا البروتوكول مع مرحلة المجهر الآلي يسمح للتصوير البلاط ثلاثي الأبعاد من عينات جبل كله في دقة ميكرون الفرعية. من الضروري تجنب التدفق نحو الأجهزة ذات الاهتمام لتحقيق التكبيل الموحد الكامل.يجب أن يكون تشريح الأوعية وربطها جراحيا فعالا. وفي الوقت نفسه احترام الأنسجة المستهدفة للحفاظ على بنية VCM الأصلية. بعد هذا الإجراء، سيتم إثراء السقالات لبروتينات ECM الهيكلية ويمكن استخدامها لقياس الطيف الكتلي أو هندسة الأنسجة.تمهد هذه التقنية الطريق إلى رسم خرائط عالية الدقة للمصفوفة خارج الخلية.

decellularization-of-the-murine-cardiopulmonary-complex

Research

JoVE Journal

Cancer Research

أبحاث السرطان

يوضح هذا الفيديو طريقة لإنتاج مصفوفة خارج الخلية منزوعة الخلايا أو سقالات ECM عن طريق تطبيق نضح المنظفات من خلال الأوعية الدموية. يمكن بعد ذلك استخدام سقالات ECM الهيكلية لتحليل إعادة تشكيل ECM المرتبطة بأمراض القلب والرئة.

إزالة الخلايا القلبية الرئوية المعقدة: تقنية لإزالة الخلايا من القلب والرئتين من نموذج الفئران

ووصف طريقة لإزالة بسرعة وبصورة كاملة المكونات الخلوية من قلب الخنزير سليمة من خلال نضح الوراء. هذه الطريقة تعطي القلب موقع خارج الخلية مصفوفة محددة سقالة الذي لديه القدرة لاستخدامها في التطبيقات السريرية المتعددة.

إجراءات Decellularization من القلب التاجي لحم الخنزير من قبل الإرواء الوراء

ينتج عن إزالة الخلايا من الأعضاء بالكامل سقالات بيولوجية طبيعية يمكن استخدامها في الطب التجديدي. يتم تقديم وصف لنموذج رئيسيات غير بشري لتجديد الرئة حيث يتم نزع الخلايا من الرئتين بالكامل ثم زرعها بالخلايا الجذعية البالغة والخلايا البطانية في مفاعل حيوي يسهل الدورة الدموية الوعائية وتهوية الوسائط السائلة.

إزالة الخلايا من الرئة غير البشرية للرئيسيات وإعادة الخلايا باستخدام مفاعل حيوي متخصص للأعضاء الكبيرة

يصف هذا البروتوكول طريقة خطوة بخطوة للعزل القابل للتكرار والثقافة طويلة الأمد لخلايا عضلة القلب في الفئران البالغة ذات الغلة العالية والنقاء والجدوى.

العزلة والثقافة وتنبيغ الخلايا العضلية ماوس الكبار

في هذه الدراسات، ونحن نقدم منهجية للرواية، حديثي الولادة، السقالات القلب الفئران للاستخدام في الدراسات التجدد.

حديثي الولادة القلب السقالات: مصفوفات رواية للدراسات التجدد

للتمييز بين انقسام الخلايا واختلافات دورة الخلية في خلايا عضلة القلب ، نقدم بروتوكولات باستخدام خطين من الفئران المعدلة وراثيا: الفئران المعدلة وراثيا Myh6-H2B-mCh ، للتحديد الواضح لنوى خلايا عضلة القلب ، وفئران CAG-eGFP-anillin ، لتمييز انقسام الخلايا عن اختلافات دورة الخلية.

تصور التغيرات دورة الخلية وتحديد في النواة في ما بعد الولادة العضلية

المصفوفة خارج الخلية القلبية (ECM) هو شبكة معقدة من الجزيئات التي تنسق العمليات الرئيسية في الأنسجة والأعضاء بينما دائم يعيد البناء الفسيولوجية طوال الحياة. رخص ديسيلولاريزيشن موحدة من قلوب الأجنة والبالغين الدراسات التجريبية المقارنة لكل الأنسجة في سياق 3D التقاط خصائص النشاط الحيوي والهندسة المعمارية الأصلية.

ديسيلولاريزيشن مماثلة لانسجة القلب الجنين والكبار Explants كمثل 3D منهاجي في المختبر الدراسات

يتيح هذا الأسلوب ديسيلولاريزيشن جهاز صلبة معقدة باستخدام بروتوكول بسيطة تستند إلى صدمة ناضح ونضح من المنظفات الأيونية مع انقطاع مصفوفة الجهاز الحد الأدنى. وهو يضم تقنية رواية ديسيلولاريزيشن لقلوب البشر داخل حقيبة مضغوط مع الرصد في الوقت الحقيقي للتدفق الخلوي وديناميات تدفق الحطام.

ديسيلولاريزيشن قلب البشري برمته داخل حقيبة الضغط في اتجاه معكوس

كلاسيكيا ، تم تحليل الشغاف من بدائية الصمام الجنيني للفأر باستخدام أقسام مستعرضة أو إكليلية أو سهمية. يسمح نهجنا الجديد للوجه والتصوير ثنائي الأبعاد للشغاف في المناطق الصمامية بالقطبية المستوية وتحليل إعادة ترتيب الخلايا للشغاف أثناء تطوير الصمام.

En Face تحضير وسادة الشغاف لتحليل التشكل المستوي في أجنة الفئران

يوضح هذا البروتوكول العزل الموجه بالفحص المجهري وتلطيخ الأوردة الرئوية للفئران. نقوم بإعداد عينات الأنسجة التي تحتوي على الأذين الأيسر والأوردة الرئوية والرئتين المقابلة وتلطيخها لقلب Troponin T و Connexin 43.

التشريح المجهري وتلطيخ التألق المناعي لأكمام عضلة القلب في الأوردة الرئوية للفئران

توضح هذه الورقة كيفية إنشاء رئتي الفئران المعدلة بيولوجيا باستخدام طرق إزالة الخلايا وإعادة الخلية. كما أنه يفصل زراعة الرئة التقويمية اللاحقة.

زرع الرئة المعدلة بيولوجيا باستخدام رئتي الفئران منزوعة الخلايا والخلايا البطانية البشرية الأولية

اكتشف بروتوكول إلغاء التفكيك لإنشاء هياكل مصفوفة خارج الخلية من قلب وفئران رئوية مع الحفاظ على السلامة البنيوية. تتيح هذه الطريقة التحليل الكيميائي الحيوي والتشريحي بدقة دون ميكرونية.

إلغاء التفكيك لمجمع مورين لأمراض القلب والعقد

استكشف المزيد من الفيديوهات