طريقة ال perfusion أنتيغراد لعزل القلب من الفئران

طورنا طريقة بسيطة خالية من Langendorff لعزل خلايا قلب الماوس الفردية عن طريق تقنية التعبئة والتغليف antegrade. تسمح هذه الطريقة بعزل خلايا القلب من الفئران الصغيرة إلى الأكبر سنا. وقد اعتبر التغلغل الرجعية المستندة إلى Langendorff كمعيار ذهبي لعزل الخلايا العضلية القلبية في مختلف الحيوانات التجريبية.

ومع ذلك ، فإن علبة LTA صعبة تقنيا في الفئران بسبب صغر حجمها. لحصاد قلب الفأر، بعد تأكيد القتل الرحيم وحلق البطن، افتح تجويف الصدر بسرعة لفضح القلب واستخدام ماصة نقل البلاستيك مع قطع طرف إلى ما يقرب من حجم القلب لامتصاص القلب في ماصة. رفع ماصة لخلق مساحة كافية لإدراج مقص المنحني واستخدام مقص لاستئصال القلب من الجانب الظهري مع الحرص على تجنب إتلاف الأذينين.

على الفور، ضع القلب في كوب زجاجي 30 ملليلتر يحتوي على الجليد البارد CIB-EGTA لمدة دقيقة واحدة تقريبا. عندما تتوقف الانقباضات، ضع القلب في طبق ثقافة 35 ملليلتر يحتوي على الجليد البارد CIB-EGTA، وإزالة الرئة والأنسجة المرئية الأخرى. ضع القلب النظيف تقريبا على حامل قلب مليء بجانب قمة CIB-EGTA المبردة إلى الأسفل ووضع الحامل تحت مجهر مجسم.

إزالة الدهون والأنسجة الضامة من جميع أنحاء الشريان الأورطي. إذا كان طول الشريان الأورطي قطع طويلة جدا، تقليم الشريان الأورطي فقط تحت الشريان العضدي وتوجيه القلب بحيث السطح الأمامي تواجه إلى الأمام. استخدام ملاقط لرفع نهاية الشريان الأورطي واستخدام المشبك الأوعية الدموية الصغيرة لمشبك الشريان الأورطي بالقرب من الأذينين في حين دفع بلطف إلى أسفل على الأذين.

ثم ضع القلب المشدد على طبق من التشوه مع الجانب الأمامي الذي يواجه القلب وترطيبه ببضع قطرات من CIB-EGTA. للتشويش المسبق، قم بتحميل حقنة 20 ملليلتر تحتوي على CIB-EGTA مسبقة الحرب متصلة بأنبوب تمديد مرن وإبرة حقن ملحوظة على مضخة التسريب وابدأ المضخة بمعدل تدفق 0.5 ملليلتر في الدقيقة. عندما يتم ملء الإبرة والمضخة، ضع إبرة الحقن على لوحة النفخ مع الجانب الأقصر من الشكل القطري في الأمام وحرك الإبرة حتى تلمس قمة القلب فقط.

أدخل الإبرة بعناية بالقرب من قمة البطين الأيسر في الغرفة البطينية دون التواء الإبرة أو فصلها عن اللوحة، ومشاهدة العلامة لتقدير عمق إدخال الإبرة. عند اكتمال إدخال الإبرة، يجب أن يبدأ الدم في التدفق من الشريان التاجي. استخدام الشريط لإصلاح إبرة الحقن إلى لوحة وزيادة سرعة المضخة إلى ملليلتر واحد في الدقيقة الواحدة.

إذا كان القلب هو perfused بنجاح ، وتدفق العازلة في الشعرية ينبغي أن تكون مرئية فقط تحت epicardium. بعد 2-3 ملليلتر من تغلغل CIB-EGTA ، استبدل حاجز التشوه بمزيج إنزيم. بعد أن يتم تغلغل 1-2 ملليلتر، قم بزيادة سرعة المضخة إلى 1.5 ملليلتر في الدقيقة.

استخدام ماصة لإزالة البيرفوسات المتراكمة التي تحتوي على الدم المتدفقة من القلب حسب الضرورة ووقف التغلغل عندما يصل الحجم الإجمالي للأنزيم المتغلغل إلى 10 ملليلتر. في نهاية التشوه، نقل 10 ملليلتر من مزيج الانزيم من الحقنة إلى طبق ثقافة 60 ملليمتر على حصيرة سخان وإضافة 20 ملليغرام من BSA إلى الطبق. دوامة بلطف الطبق لإذابة مسحوق وإزالة إبرة الحقن والمشبك من القلب.

إزالة البطينين والأدريا من القلب ووضع الأنسجة في مزيج الانزيم المكملة ب BSA. لعزل الخلايا الن البطينية، استخدم زوجين من الملاقط لفهم البيكارديوم وسحب البطينين برفق إلى قطع صغيرة. عندما يتم إنشاء جميع شظايا البطين، تفريق الخلايا حوالي 30 مرة مع pipetting لطيف وتصفية الحطام غير المهضوم من خلال مصفاة خلية شبكة 100 ميكرون في أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر.

بعد الطرد المركزي، وإعادة إنفاق بيليه عضلة القلب في CIB prewarmed تكملها الكالسيوم وBSA واحتضان الخلايا لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، والطرد المركزي الخلايا مرة أخرى وإعادة إنفاق خلايا القلب عجلت في حجم مناسب من محلول إعادة إيقاف الخلية لصيانتها في 37 درجة مئوية حتى تحليل المصب. لعزل الخلايا العضلية الأذينية، نقل الأذين إلى وعاء من CIB قبل الحرب تستكمل مع الكالسيوم وBSA وتمزيق الأذينين إلى قطع كما هو موضح.

استخدام ماصة 20 ميكرولتر تعيين إلى 10 ميكرولتر لتعطيل الأنسجة عن طريق الأنابيب وجمع الخلايا المفككة عن طريق الطرد المركزي. ثم إعادة إنفاق الخلية الأذينية في حجم مناسب من محلول إعادة الإنفاق الخلية. في هذه الصورة ، يمكن ملاحظة الخلايا العضلية البطينية المعزولة حديثا.

يؤدي إجراء العزل هذا إلى إنتاجية تتراوح بين 70 و80٪ من الخلايا البطينية البطينية على شكل قضيب من الفئران التي يتراوح عمرها بين ثمانية أسابيع و10 أسابيع في غضون خمس ساعات تقريبا من العزلة. نسبة الخلايا القابلة للحياة المعزولة حديثا أقل في الفئران التي يزيد عمرها عن عامين. إمكانات العمل المسجلة في الخلايا العضلية البطينية والبطينية مماثلة لتلك التي تقاس في الخلايا التي تم الحصول عليها من خلال الطريقة القائمة على Langendorff.

يمكن استخدام تحليل المناعة لتقييم تنظيم الهيكل الساركوميري للخلايا العضلية البطينية وتحويل الخلايا الليفية القلبية إلى الخلايا الليفية العضلية بعد الثقافة الفرعية. يوصى بتحليل البقع الغربية لتحديد التعبير المحدد للبروتينات ذات الاهتمام في الأذينين والبطينين بعد المعالجة. بعد التخثر مع الانزيمات، يمكن تجانس البروتينات من الأذينين والبطينين بسهولة في عازلة التحلل مع قوة الضوء لاستخراج البروتين.

من المهم التحكم في اتجاه وأعماق إدخال الإبرة. عند إدخال الإبرة في البطين الأيسر، يجب الحرص على عدم اختراق الحاجز البطيني أو اختراق الصمام. يمكنك تغيير تكوين perfusate اعتمادا على الغرض من التجربة.

على سبيل المثال، يمكن استخدام المنظفات المكملة EGTA لجعل سقالة خالية من الخلايا من القلب.