التصوير الخالي من التسميات لديناميكيات تخزين الدهون في Elegans Caenorhabditis باستخدام المجهر التشتت رامان المحفزة

تحفيز رامان متناثرة المجهر هو تكنولوجيا التصوير الكيميائي التي تمكن من الكشف السريع والكمي من الدهون ويسمح لتتبع الدهون في الحيوانات الحية بطريقة خالية من التسمية. أهم ميزة للفحص المجهري SRS على تقنيات الكشف عن الدهون التقليدية هي أنه خال من التسمية ، وبالتالي ، ليس مستداما لتبييض الصور مثل مسائل الفلورسينس والتلوين الأخرى. استخدام المجهر SRS بالتزامن مع الأدوات الوراثية والبيوكيميائية المتاحة للكائنات الحية النموذجية، ولا سيما Caenorhabditis elegans يوفر إطارا قويا لدراسة المنظمين العاديين لبيولوجيا الدهون والتمثيل الغذائي.

لتغذية أشعة الليزر في المجهر SRS، أولا، تعيين periscope لرفع شعاع من مخرج مصدر الضوء picosecond إلى منفذ إدخال الليزر الأشعة تحت الحمراء على الماسح الضوئي للمجهر وفتح برنامج التحكم بالليزر لبدء الليزر. خفض طاقة الليزر مضخة إلى 50 ملليواط وتعيين إشارة مضخة إلى 750 نانومتر. استخدم موسع شعاع لضبط قطر الحزمة لتناسب الفتحة الخلفية لأهداف المجهر.

استخدم مرآتين للتتابع، M1 و M2، لتوجيه شعاع الليزر إلى المنظار وتعيين إيماءات المنظار في وسط نطاق الضبط. حدد الموضع الأولي وزاوية كل مرآة بحيث يضرب شعاع الليزر تقريبا مركز المرآة لإطلاق الشعاع في المجهر واستخدام منفذ فارغ على البرج الموضوعي للمجهر لأداء محاذاة الدورة. ضع مسبار مقياس الطاقة في المنفذ الموضوعي لقياس قوة الضوء المرسل وتعيين الماسح الضوئي للمجهر عند أعلى تكبير ، 50X.

قياس قوة الضوء المنقول مع بقعة شعاع الليزر مركزة وتحسين المقابض من المرايا M1 و M2 تكراريا لتحقيق أعلى قوة الليزر المرسلة. استخدم أداة المحاذاة لتنفيذ المحاذاة الدقيقة للضوء المرسل للتأكد من مرور الضوء عبر مركز الهدف ووضع غطاء محاذاة الهدف الفلوري على المقعد الموضوعي الفارغ. ضبط المقابض من مرآة التوجيه الأولى، M1، إلى مركز بقعة شعاع الليزر وإدخال أنبوب التمديد مع غطاء المحاذاة على الطرف الآخر إلى مقعد موضوعي فارغ لرصد بقعة شعاع الليزر.

ثم، ضبط المقابض من مرآة التوجيه الثانية، M2، لمركز بقعة شعاع الليزر مرة أخرى على الطرف الآخر من أنبوب التمديد. لإعداد وحدة الكشف عن SRS ، ضع مكعب مقسم شعاع بعد المكثف لتوجيه الليزر المرسلة إلى وحدة صمام ثنائي الصورة. لإعداد اتصال الالكترونيات، استخدم المغير البصري الكهربائي المدمج في 20 ميغاهيرتز داخل الليزر بيكوثانية لحن قادرة على تعديل كثافة شعاع ستوكس وتغذية إشارة الإخراج من الصمام الثنائي الصورة في مكبر للصوت قفل في لإحباط فقدان رامان حفز.

ثم، تغذية إخراج مكبر للصوت قفل في المربع التناظرية من المجهر لتحويل إشارة التناظرية الكهربائية إلى إشارة رقمية. لتحسين ظروف التصوير، أضف خمسة ميكرولترات من حمض الأوليك إلى غرفة شرائح المجهر المصغرة وغط العينة بزلة غطاء. ضع العينة على مرحلة المجهر واستخدم حافة الوسادة لتحديد موقع القطيرات والتركيز عليها.

ضبط المكثف للإضاءة كولر واستخدام بطاقة استشعار الأشعة تحت الحمراء والعارض الأشعة تحت الحمراء للتحقق ما إذا كان مسار شعاع مضخة لا يزال صحيحا. تأكد من أن مرحلة التأخير يتم تعيينها إلى صفر femtoseconds وتعيين الطول الموجي شعاع مضخة إلى 795.8 نانومتر. تعيين قوة شعاع مضخة إلى 50 ملليواط وتعيين شعاع ستوك إلى 100 ملليواط.

فتح مصراع لكل من الحزم، فضلا عن مصراع الرئيسي لليزر. مسح العينة ضوئيا والتحقق من الصورة على شاشة الكمبيوتر. تغيير وضع العرض إلى مستوى منخفض مرتفع وضبط النطاق لرؤية تشبع بنسبة 50٪ تقريبا.

تحقق مما إذا كان التشبع يتمحور في الصورة ، وضبط مرايا التوجيه بعناية داخل نظام الليزر القادر على ضبط picosecond للتداخل الأمثل للمضخة وS ستوكس لزيادة كثافة الصورة وتوسيط كثافة الذروة حسب الضرورة. قبل كل جلسة تصوير، أضف 100 ميكرولتر من الآغاروز الدافئ بنسبة 2٪ إلى شريحة زجاجية نظيفة موضوعة بين شرائح الدعم مع طبقتين من الشريط المختبري ووضع شريحة ثانية بسرعة أعلى الشريحة الأولى. ضغطت بلطف لخلق رقيقة، حتى، وسادة الآغاروز والسماح للgarose لتبرد.

لتركيب الديدان للتصوير ، ضع قطرة من أربعة إلى خمسة ميكرولتر من عامل التخدير لكل 10 إلى 20 دودة على زلة غطاء واستخدم مجهر تشريح لاختيار الديدان التي سيتم تصويرها ، ووضع الديدان على قطرة التخدير أثناء جمعها. عندما يتم جمع جميع الديدان ، قم بتغطية الديدان بالشريحة الزجاجية مع لوحة الآغاروز. للتصوير، قم بتركيب عينة الدودة مع زلة الغطاء التي تواجه العدسة الموضوعية وتوجيه مصدر ضوء الحقل الساطع إلى العدسة لتحديد موقع الديدان.

جلب الديدان في التركيز وضبط موقف المكثف وفقا لذلك. ضبط القوى الليزر عن طريق تعيين مضخة ليزر الطاقة إلى 200 مللي واط وقوة الأشعة تحت الحمراء إلى 400 مللي واط. تعيين مكبر للصوت قفل في لdemodulation من إشارة SRS دودة.

ابدأ بمسح الدودة الأولى بمعدل مسح سريع، وضبط التركيز الدقيق للعثور على منطقة الاهتمام. عند تحسين الإشارة، قم بالتبديل إلى معدل مسح ضوئي أبطأ ودقة بكسل أعلى للحصول على صورة SRS وحفظ الصورة بتنسيق يتيح دقة عالية. عندما يتم تصوير جميع العينات، ضع مصدر الليزر على أهبة الاستعداد وإيقاف تشغيل جميع المعدات المرتبطة بها.

لتحليل الصور، افتح الملفات في ImageJ وحدد تحليل وتعيين القياسات لتحديد الخصائص التي سيتم تحليلها. استخدم أداة اختيار المضلع لتحديد منطقة الأمعاء الدودية ليتم قياسها كميا والنقر على التحليل والتدبير مرة أخرى. ستظهر القياسات في إطار النتائج.

عندما يتم تحديد جميع الديدان ، قم بنسخ ولصق القياسات لكل من الديدان في نمط جيني معين في جدول بيانات. بالنسبة لقيمة قياس الخلفية، حدد منطقة في جوار الدودة التي لا تحتوي على أي إشارة SRS وطرح قيمة خلفية متوسط الرمادي من القياس لكل دودة فردية لحساب متوسط الانحراف المعياري للخلفية مطروحا متوسط القيم الرمادية من كافة worms في مجموعة اختبار أو نمط جيني معين. يمكن بعد ذلك تسوية هذه القيم إلى متوسط مجموعة التحكم.

في هذا التحليل التمثيلي، تم قياس مستويات الدهون المعوية في الديدان البرية المتزامنة مع العمر والمسوخ daf-2 التي تفتقر إلى مستقبلات الأنسولين كميا خلال مرحلة البلوغ. كما هو متوقع، لوحظ انخفاض في مستويات الدهون في الديدان البرية، بدءا من اليوم الأول وتستمر حتى اليوم التاسع من مرحلة البلوغ. ومع ذلك ، فإن مستويات الدهون في المسوخ daf-2 ، تزداد حتى يبلغ عمرها خمسة أيام ، وعند هذه النقطة تظل ثابتة عند حوالي 2.5 إلى ثلاثة أضعاف أعلى من النوع البري.

تعطيل داف-16 يقمع الزيادة في مستويات الدهون من المسوخ داف-2. التعبير عن daf-16a a أو daf-16b isoform في daf-2، daf-16 المسوخ المزدوجة لا يعيد مستويات الدهون. التعبير عن daf-16d/f/h isoform، ومع ذلك، كافية لاستعادة مستويات الدهون في داف-2، داف-16 المسوخ المزدوجة إلى المستويات التي لوحظت في المسوخ واحد داف-2.

وتشير هذه النتائج إلى أن daf-16d/f/h isoform يعدل بالتحديد عملية التمثيل الغذائي للدهون في الديدان المتحولة daf-2. من المهم استخدام نفس قوة الليزر لعوارض المضخة وستيكس طوال جلسة التصوير وتضمين مجموعة تحكم في كل ستة وأربعة تحديد كمي ثابت. بالإضافة إلى قياس تخزين الدهون، يمكن أن يقترن المجهر SRS مع العلامات البيولوجية، مثل الديوتريوم، وتنفيذها لتصور ديناميات دمج الدهون، والتوليف والتدهور.

يسمح الفحص المجهري SRS بالتعدد ويمكن تنفيذه لتصوير الجزيئات الحيوية المتعددة في مقصورات فرعية مختلفة. ما يسمى المجهرية SRS hyperspectral له مستقبل عظيم في استكشاف ديناميات التمثيل الغذائي.