إنتاج البروتينات الخالية من الخلايا للتحليل الوظيفي وتطوير الأجسام المضادة التي تستهدف البروتينات الغشائية

جميع بروتينات الغشاء هي أهداف مهمة في اكتشاف الأدوية. لا يزال الإنتاج الأكبر لبروتينات الغشاء على نطاق واسع عنق الزجاجة لإجراء دراسات بروتين الغشاء الكيميائي الحيوي والفيزيائي الحيوي والهيكلي. يمكن استخدام هذه الطريقة لتصنيع بروتينات الغشاء بكفاءة في المختبر ولتحضير البروتينات المنقاة في وقت قصير بمعدل نجاح مرتفع.

بعد إضافة الكواشف المناسبة ، بما في ذلك البلازميد الخلوي الخالي من الخلايا لتوليد خليط تفاعل النسخ ، امزج محتويات الأنبوب عن طريق الانعكاس اللطيف أو النقر وقم بإجراء دوران سريع في جهاز طرد مركزي دقيق. بعد الدوران ، احتضان خليط تفاعل النسخ لمدة ست ساعات عند 37 درجة مئوية متبوعا بالخلط وخطوة الدوران. لتحضير المخزن المؤقت للترجمة ، قم بتخفيف محلول المخزون بالماء العذب عالي النقاء.

للترجمة على نطاق صغير ، استخدم 100 ميكرولتر من أكواب غسيل الكلى المغسولة بالماء فائق النقاء لإزالة الجلسرين من غشاء غسيل الكلى. أضف ملليلترا واحدا من الماء فائق النقاء إلى أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر وأدخل كوب غسيل الكلى صغير الحجم في الأنبوب. ثم أضف 500 ميكرولتر من الماء عالي النقاء إلى الكوب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

لتحضير الجسيمات الشحمية ، انقل محلول دهني يحتوي على 50 ملليغرام من الدهون إلى قارورة التبخر. ضع القارورة في مبخر دوار لتبخير المذيب. عندما يتم إنشاء طبقة رقيقة منتشرة بالتساوي من الدهون على سطح قاع القارورة ، انقل القارورة إلى مجفف فراغ تحت ضغط سلبي طوال الليل لإزالة المذيب تماما.

في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة القوارير من المجفف وتحقق من الطبقة الرقيقة من الدهون. أضف ملليلترا واحدا من مخزن الترجمة المؤقت إلى القارورة وقم بتدوير القارورة لنشر المخزن المؤقت على الطبقة الدهنية الرقيقة. بعد خمس دقائق ، صوتنة القارورة وتغيير الزاوية من حين لآخر للسماح للمحلول بالاتصال بسطح الفيلم الدهني بالكامل.

توقف عن الصوتنة عندما يتم تجريد الدهون تماما من القارورة ويصبح تعليق الجسيم الشحمي موحدا. ثم انقل تعليق الجسيمات الشحمية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل. قبل إجراء ترجمة البروتين في المختبر ، قم بتعويم أنبوب من مستخلص جنين القمح من تخزين 80 درجة تحت الصفر على الماء في درجة حرارة الغرفة لبضع دقائق لإذابة المادة بسرعة.

عند إذابة المستخلص ، امزج محتويات الأنبوب على الفور عن طريق الانعكاس اللطيف. ثم قم بالدوران وضع الأنبوب على الجليد. أضف مستخلص جنين القمح mRNA والجسيمات الشحمية لتوليد خليط تفاعل الترجمة.

امزج محتويات الأنبوب عن طريق الانعكاس اللطيف أو النقر وقم بإجراء دوران سريع في جهاز طرد مركزي دقيق. لإجراء ترجمة بروتين في المختبر على نطاق صغير ، قم بإزالة الماء من كوب وأنبوب غسيل الكلى على نطاق صغير وأضف ملليلترا واحدا من مخزن الترجمة إلى الأنبوب و 300 ميكرولتر إلى الكوب. خذ 60 ميكرولترا من خليط تفاعل الترجمة.

أدخل طرف الماصة في مخزن الترجمة المؤقتة في كوب غسيل الكلى. ثم حقن الخليط ببطء وبلطف. يغرق خليط التفاعل ذو الكثافة العالية تلقائيا في قاع الكوب ويشكل طبقة.

غطي الكوب بغطاء لمنع التبخر. لإجراء ترجمة واسعة النطاق ، أضف 22 مل من مخزن الترجمة إلى أنبوب سعة 25 مليلتر وضع كوب غسيل الكلى سعة ملليلتر في الأنبوب. أضف ملليلترين من مخزن الترجمة إلى كوب غسيل الكلى.

خذ 500 ميكرولتر من خليط تفاعل الترجمة ، وقم بحقن الخليط ببطء وبرفق في مخزن الترجمة في الكوب. احتضان التفاعلات لمدة 24 ساعة عند 15 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قم بخلط التفاعل جيدا في كوب غسيل الكلى عن طريق ماصة ونقل معلقات البروتيوليبوسوم الخام إلى أنابيب جديدة.

لتنقية البروتينات ، قم بترسيب البروتينات في المعلقات الخام عن طريق المركزية. ثم اغسل البروتيوليبوسوم عن طريق إعادة التعليق في الحجم المناسب من المخزن المؤقت PBS المثلج ثلاث مرات. بعد الغسيل ، قم بإعادة تعليق كريات البروتيوليبوسوم تماما في حجم صغير من PBS وقم بقياس حجم التعليق باستخدام ماصة دقيقة.

ثم أضف PBS لضبط حجم التعليق. انقل كل تعليق إلى أنبوب صغير جديد. لإعداد تحليل صفحة SDS ، أضف 70 ميكرولترا من الماء و 40 ميكرولترا من المخزن المؤقت لعينة صفحة SDS المركز ثلاث مرات إلى 10 ميكرولتر من كل تعليق بروتيني أوليبوسوم.

قم بإعداد هلام صفحة SDS متدرج من خمسة إلى 20٪ في غرفة الرحلان الكهربائي. قم بتحميل الجل بميكرولترين من علامة حجم البروتين ثلاثة وستة و 12 ميكرولتر من كل عينة من البروتينات و 10 ميكرولترات من معايير ألبومين مصل الأبقار. بعد تحميل العينات ، قم بتشغيل الرحلان الكهربائي متبوعا بتلطيخ الجل بصبغة Coomassie Brilliant Blue.

أخيرا ، قم بإزالة لون الجل بالماء الساخن مع رج لطيف ومسح صورة الجل. باستخدام هذا البروتوكول كما هو موضح ، يمكن بسهولة إنتاج مجموعة متنوعة من بروتينات الغشاء التي تحتوي على ثلاثة أو أكثر من الحلزونات عبر الغشاء كبروتينات في وقت قصير. في طريقة غسيل الكلى ثنائية الطبقة هذه ، يمكن إجراء الإمداد المستمر بالركائز وإزالة المنتج الثانوي بكفاءة في كل من الجزء العلوي والسفلي من خليط التفاعل على مدى فترة طويلة من الزمن ، مما يؤدي إلى فعالية ترجمة ممتازة.

تؤدي طريقة غسيل الكلى ثنائية الطبقة إلى زيادة الإنتاجية بمقدار أربعة إلى 10 أضعاف مقارنة باستخدام طرق الطبقة الثنائية أو غسيل الكلى وحدها. إن جمع البروتينات المركبة عن طريق التمركز وتنقيتها جزئيا باستخدام مخزن مؤقت للغسيل يقصر بشكل كبير عملية تنقية بروتينات الغشاء. هذا النظام الخالي من الخلايا سهل التلاعب وقابل للتطوير بدرجة كبيرة.

يمكن استخدامه أيضا لإنتاج بروتينات الذاكرة التي يصعب التعبير عنها باستخدام طرق أخرى. هذه الطريقة مفيدة للغاية للتحقيقات والتجارب التي تستخدم أو تستهدف بروتينات الغشاء مثل البروتين المضاد للأغشية وإنتاج الأجسام المضادة و SPR و Elisa و AlphaScreen.