البيض Microinjection وكفاءة التزاوج لتحرير الجينوم في Firebrat ثيرامبيا المحلية
October 20th, 2020
نحن نقدم بروتوكول مفصل لتربية, microinjection من البيض و التزاوج كفاءة من firebrat ثيرامبيا المحلية لتوليد والحفاظ على سلالات متحولة بعد تحرير الجينوم.
نظرا لأن Thermobia domestica هي حشرة قاعدية ، فإن الدراسات الجينية على هذا النوع ستلقي الضوء على الآليات الكامنة وراء تطور الابتكارات الرئيسية في الحشرات ، مثل الطيران الكهربائي والتحولات. يغطي هذا البروتوكول التقنيات الأساسية من صيانة الاستزراع إلى الحقن المجهري للبيض لتنفيذ Thermobia كنوع نموذجي مختبري. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لتطبيق أدوات وراثية أخرى مثل ضربة قاضية للجينات بوساطة RNI ، والتحول في الثيرمبيا.
احتفظ بالنوع البري والمجموعات المتحولة في وعاء بلاستيكي كبير مع طعام أسماك اصطناعي منتظم ، وماء في أكواب بلاستيكية مع فتحة تهوية في الأعلى ، وورق مطوي لإخفاء الحشرات وقطن متعدد الطبقات لوضع البيض. احتفظ بجميع مزارع T.domestica داخل حاضنات 37 درجة مئوية واضبط الرطوبة النسبية داخل كل حاوية على 60 إلى 80٪ لتحضير مستعمرات جمع البيض ، انقل حوالي 20 ذكرا و 20 من الإناث البالغين إلى وعاء متوسط الحجم به طعام وإمدادات مياه وورق مطوي وقطعة صغيرة من القطن ذي الطبقات لوضع البيض. قم بإعداد عدة مستعمرات للحصول على عدد كبير من الأجنة المرحلية في غضون فترة زمنية قصيرة.
في يوم الحقن ، استبدل القطن داخل الحاويات بقطن جديد. بعد ثماني ساعات ، اجمع البيض من القطن ذي الطبقات عن طريق فصل الطبقات باستخدام الملقط. قم بمحاذاة البيض على الشريط اللاصق على الوجهين باستخدام فرشاة طلاء مبللة مع الحفاظ على مسافة ملليمترين بين البيض.
يجب توجيه جميع البيض بحيث يواجه المحور الطولي للبيضة جانب الحقن. اضغط برفق على البيض لأسفل بفرشاة الرسم لتثبيته بقوة أثناء الحقن. قم بتحميل ميكرولترين من محلول gRNA CAS9 في شعرية حقن الزجاج باستخدام محمل صغير.
تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في المحلول قبل الحقن. إذا لزم الأمر ، اضغط على الإبرة لإزالة الفقاعات. قم بتحسين شكل طرف الإبرة عن طريق كسرها قليلا بالملقط لمنع الانسداد والحصول على متانة أفضل خلال سلسلة من الحقن.
أدخل الإبرة في منتصف المحور الطولي للبويضة وحقن كمية صغيرة من المحلول. اضبط تكوين الحاقن الإلكتروني الصغير أثناء الحقن ، اعتمادا على شكل طرف الإبرة. احتفظ بالبويضات المحقونة في وعاء بحجم مناسب مع رطوبة نسبية من 60 إلى 80٪ عند 37 درجة مئوية.
افحص البيض المحقون بشكل دوري وتخلص من البيض التالف لتجنب نمو الفطريات. إذا كان هناك الكثير من الفطريات التي تنمو على البيضة ، فقم بتنظيف سطح البيضة بنسبة 70٪ من الإيثانول. قبل الفقس ، اغمس الشريحة الزجاجية مع البيض المحقون في بودرة التلك لتغطية سطح الشريط على الوجهين.
هذا سيمنع تكديس الحوريات المفرغة. انقل الشرائح الزجاجية المطلية بالمسحوق إلى وعاء متوسط الحجم به طعام وماء وورق مطوي. اعزل الحوريات G1 إلى 24 لوحة بئر باستخدام شفاط أو فرشاة رسم.
الحفاظ على إمدادات أغذية الأسماك الاصطناعية العادية. ضع ألواح الآبار ال 24 في وعاء أكبر مع إمدادات المياه لرطوبة 60 إلى 80٪ قرصة واسحب cercus من حورية أو شخص بالغ باستخدام ملقط واجمعها في أنبوب 0.2 مليلتر يحتوي على 50 ميكرولتر من الإيثانول. قم بتخزين العينات التي تم جمعها عند سالب 20 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.
ضع أنابيب العينة مع فتح الأغطية على كتلة حرارية لمدة 15 دقيقة عند 70 درجة مئوية لتبخر الإيثانول. يؤدي حقن مركب البروتين النووي الريبي gRNA CAS9 في الأجنة خلال الساعات الثماني الأولى بعد وضع البيض إلى إندلس في الموقع المستهدف gRNA. هذا يسبب طفرات ثنائية الأليلات في بعض خلايا الجيل المحقون وعادة ما يتم الحصول على أنماط ظاهرية للفسيفساء الطافرة.
عندما تم استخدام هذا البروتوكول لحقن الحمض النووي الريبي الحمض النووي الريبي الذي تم تصميمه لاستهداف الجين الأبيض ، أظهرت 32.6٪ من حوريات G0 فقدانا جزئيا للتصبغ في عيونهم المركبة والمناطق الظهرية. تم تقييم تحول السلالة الجرثومية للبالغين G0 وأفراد G1 المتحولين عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الجيني متبوعا بفحص الحركة المزدوجة غير المتجانسة. في عينات G1 ، يمكن تمييز أنماط النطاق التفاضلي بين العينات البرية والمتحولة بوضوح.
يوفر تحرير الجينوم في Thermobia نهجا قويا لتحليل الآليات الجينية الكامنة وراء السمات المبكرة للحشرات. يساعد على استكشاف الأسرار الكامنة وراء نجاحهم المتميز ونجاحنا.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولًا شاملًا لتربية وحقن الميكروإبر لبيض حشرة Thermobia domestica، مما يسهل توليد والحفاظ على سلالات الطافرة من خلال تحرير الجينوم. ستعزز الطرق المحددة استخدام Thermobia كنوع نموذجي للمختبر للدراسات الوراثية.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلوم
- الوراثة
- بيولوجيا الحشرات
- بروتوكولات المختبر
الخلفية
- Thermobia domestica هي نوع من الحشرات الأساسية.
- الدراسات الوراثية على هذا النوع يمكن أن تكشف عن رؤى حول تطور الحشرات.
- الابتكارات الرئيسية في الحشرات تشمل الطيران المدعوم والتمايز.
- هذا البروتوكول يدعم تطبيق الأدوات الوراثية في Thermobia.
غرض الدراسة
- لتأسيس Thermobia domestica ككائن نموذجي للبحث الجيني.
- لتوفير منهجية مفصلة لميكروإبر البيض.
- لتسهيل الحفاظ على سلالات النوع البري والطافرة.
الطرق المستخدمة
- الحفاظ على الثقافة في حاويات بلاستيكية كبيرة.
- حقن الميكروإبر للبيض لتحرير الجينوم.
- تغذية منتظمة مع طعام أسماك صناعي.
- ضبط الظروف البيئية عند 37°C ورطوبة 60-80%.
النتائج الرئيسية
- التأسيس الناجح لمستعمرات التربية لجمع البيض.
- توليد فعال للجنين المرتب للبحث.
- الحفاظ على كل من السلالات الطبيعية والطافرة.
- تطبيق الأدوات الوراثية لمزيد من الدراسات.
الاستنتاجات
- Thermobia domestica هي نموذج واعد للدراسات الوراثية.
- البروتكول المحدد يعزز جدوى التلاعب الجيني.
- يمكن للبحوث المستقبلية الاستفادة من هذه الطرق للحصول على رؤى تطورية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Genome editing in Thermobia domestica enables functional genetic interrogation in a basal insect model, supporting evolutionary and developmental biology pipelines. The protocol's robust microinjection and colony management steps facilitate reproducible generation of mutant strains, expanding the toolkit for non-traditional model systems. This capability strengthens early discovery and target validation for insect biology and comparative genomics portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct testing of gene function in a basal insect lineage.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying gene-phenotype relationships.
- Facilitates hypothesis-driven exploration of evolutionary innovations.
- Provides a platform for functional target validation in non-model organisms.
Screening & Assay Development
- Establishes standardized protocols for embryo microinjection and mutant generation.
- Delivers reproducible, quantitative phenotypic outputs for downstream analysis.
- Prepares validated biological systems for genetic screening workflows.
- Enables scalable colony management for high-throughput studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with comparative studies of gene function across insect taxa.
- Supports continuity from genetic manipulation to phenotypic assessment.
- Provides a foundation for translational biomarker discovery in evolutionary contexts.
- De-risks preclinical model selection by expanding available genetic tools.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early genetic manipulation to phenotypic screening and comparative analysis in insect models.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification in a basal insect system.
- Screening: Provides reproducible mutant phenotypes for assay development and validation.
- Analytics: Supports quantitative assessment of gene editing outcomes via PCR and mobility assays.
- Translational Research: Facilitates cross-species genetic comparisons relevant to evolutionary biology.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable protocol adaptable to other non-traditional insect models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in gene function studies and evolutionary hypotheses.
- Operational Value: Standardizes microinjection and colony management for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions in comparative genomics and model selection.
- Portfolio Impact: Expands the range of genetically tractable insect models for R&D prioritization.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection and insect colony management.
- Needs access to controlled incubators and humidity regulation infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible mutant generation.
- Adaptation may be necessary for other insect species with differing biology.
- Limitations include species-specific handling and environmental requirements.
