البيض Microinjection وكفاءة التزاوج لتحرير الجينوم في Firebrat ثيرامبيا المحلية

نظرا لأن Thermobia domestica هي حشرة قاعدية ، فإن الدراسات الجينية على هذا النوع ستلقي الضوء على الآليات الكامنة وراء تطور الابتكارات الرئيسية في الحشرات ، مثل الطيران الكهربائي والتحولات. يغطي هذا البروتوكول التقنيات الأساسية من صيانة الاستزراع إلى الحقن المجهري للبيض لتنفيذ Thermobia كنوع نموذجي مختبري. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لتطبيق أدوات وراثية أخرى مثل ضربة قاضية للجينات بوساطة RNI ، والتحول في الثيرمبيا.

احتفظ بالنوع البري والمجموعات المتحولة في وعاء بلاستيكي كبير مع طعام أسماك اصطناعي منتظم ، وماء في أكواب بلاستيكية مع فتحة تهوية في الأعلى ، وورق مطوي لإخفاء الحشرات وقطن متعدد الطبقات لوضع البيض. احتفظ بجميع مزارع T.domestica داخل حاضنات 37 درجة مئوية واضبط الرطوبة النسبية داخل كل حاوية على 60 إلى 80٪ لتحضير مستعمرات جمع البيض ، انقل حوالي 20 ذكرا و 20 من الإناث البالغين إلى وعاء متوسط الحجم به طعام وإمدادات مياه وورق مطوي وقطعة صغيرة من القطن ذي الطبقات لوضع البيض. قم بإعداد عدة مستعمرات للحصول على عدد كبير من الأجنة المرحلية في غضون فترة زمنية قصيرة.

في يوم الحقن ، استبدل القطن داخل الحاويات بقطن جديد. بعد ثماني ساعات ، اجمع البيض من القطن ذي الطبقات عن طريق فصل الطبقات باستخدام الملقط. قم بمحاذاة البيض على الشريط اللاصق على الوجهين باستخدام فرشاة طلاء مبللة مع الحفاظ على مسافة ملليمترين بين البيض.

يجب توجيه جميع البيض بحيث يواجه المحور الطولي للبيضة جانب الحقن. اضغط برفق على البيض لأسفل بفرشاة الرسم لتثبيته بقوة أثناء الحقن. قم بتحميل ميكرولترين من محلول gRNA CAS9 في شعرية حقن الزجاج باستخدام محمل صغير.

تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في المحلول قبل الحقن. إذا لزم الأمر ، اضغط على الإبرة لإزالة الفقاعات. قم بتحسين شكل طرف الإبرة عن طريق كسرها قليلا بالملقط لمنع الانسداد والحصول على متانة أفضل خلال سلسلة من الحقن.

أدخل الإبرة في منتصف المحور الطولي للبويضة وحقن كمية صغيرة من المحلول. اضبط تكوين الحاقن الإلكتروني الصغير أثناء الحقن ، اعتمادا على شكل طرف الإبرة. احتفظ بالبويضات المحقونة في وعاء بحجم مناسب مع رطوبة نسبية من 60 إلى 80٪ عند 37 درجة مئوية.

افحص البيض المحقون بشكل دوري وتخلص من البيض التالف لتجنب نمو الفطريات. إذا كان هناك الكثير من الفطريات التي تنمو على البيضة ، فقم بتنظيف سطح البيضة بنسبة 70٪ من الإيثانول. قبل الفقس ، اغمس الشريحة الزجاجية مع البيض المحقون في بودرة التلك لتغطية سطح الشريط على الوجهين.

هذا سيمنع تكديس الحوريات المفرغة. انقل الشرائح الزجاجية المطلية بالمسحوق إلى وعاء متوسط الحجم به طعام وماء وورق مطوي. اعزل الحوريات G1 إلى 24 لوحة بئر باستخدام شفاط أو فرشاة رسم.

الحفاظ على إمدادات أغذية الأسماك الاصطناعية العادية. ضع ألواح الآبار ال 24 في وعاء أكبر مع إمدادات المياه لرطوبة 60 إلى 80٪ قرصة واسحب cercus من حورية أو شخص بالغ باستخدام ملقط واجمعها في أنبوب 0.2 مليلتر يحتوي على 50 ميكرولتر من الإيثانول. قم بتخزين العينات التي تم جمعها عند سالب 20 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.

ضع أنابيب العينة مع فتح الأغطية على كتلة حرارية لمدة 15 دقيقة عند 70 درجة مئوية لتبخر الإيثانول. يؤدي حقن مركب البروتين النووي الريبي gRNA CAS9 في الأجنة خلال الساعات الثماني الأولى بعد وضع البيض إلى إندلس في الموقع المستهدف gRNA. هذا يسبب طفرات ثنائية الأليلات في بعض خلايا الجيل المحقون وعادة ما يتم الحصول على أنماط ظاهرية للفسيفساء الطافرة.

عندما تم استخدام هذا البروتوكول لحقن الحمض النووي الريبي الحمض النووي الريبي الذي تم تصميمه لاستهداف الجين الأبيض ، أظهرت 32.6٪ من حوريات G0 فقدانا جزئيا للتصبغ في عيونهم المركبة والمناطق الظهرية. تم تقييم تحول السلالة الجرثومية للبالغين G0 وأفراد G1 المتحولين عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الجيني متبوعا بفحص الحركة المزدوجة غير المتجانسة. في عينات G1 ، يمكن تمييز أنماط النطاق التفاضلي بين العينات البرية والمتحولة بوضوح.

يوفر تحرير الجينوم في Thermobia نهجا قويا لتحليل الآليات الجينية الكامنة وراء السمات المبكرة للحشرات. يساعد على استكشاف الأسرار الكامنة وراء نجاحهم المتميز ونجاحنا.