قياس إمكانات العمل البصري أحادي الخلية في خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات

يمكن أن يوفر هذا البروتوكول قياسات إنتاجية عالية للفيزيولوجيا الكهربية الخلوية بطريقة تناسب التكنولوجيا سريعة التطور لخلايا عضلة القلب المستحثة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها أقل تعقيدا وأقل كثافة في العمالة من تقنية مشبك التصحيح التقليدية ، ومع ذلك فهي قادرة على تحقيق نتائج مكافئة. لذلك يمكن توسيع هذا البروتوكول لبرامج فحص السمية على نطاق واسع باستخدام خلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان.

على سبيل المثال ، الفحص الشامل في المختبر لاضطراب النظم القلبي. لإعداد مزارع خلايا عضلة القلب المستحثة متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية للتجربة ، قم أولا بتغطية الغطاء الفردي الفردي 10 ملم بحجم 10 ملم من الزجاج المستدير رقم صفر مع 150 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي 1:60 داخل كل بئر من صفيحة 24 بئرا ، واحتضان زلات الغطاء عند أربع درجات مئوية لمدة أربع ساعات. في نهاية الحضانة ، قم بإزالة المصفوفة الزائدة من زلات الغطاء وقم بتطبيق الحجم المناسب من الخلايا على كل زلة غطاء.

بعد ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية ، املأ كل بئر بعناية بوسط الطلاء وأعد اللوحة إلى الحاضنة. للتحضير لتصوير الصبغة الحساسة للجهد ، قم بتجهيز مجهر epifluorescence مقلوب بعدسة ذات فتحة عددية عالية التكبير 40x ، وقم بإقران مصباح LED أبيض دافئ سريع التبديل بمنفذ الإضاءة المرسل. أدخل مرشحا أحمر بسيطا 660 نانومتر في مسار الضوء المرسل وقم بتركيب رأس LED سريع التبديل 470 نانومتر لتسجيل القياس الضوئي.

أدخل مرشح إثارة 470/40 في منفذ التألق لتنظيف الضوء الناتج عن LED ، وأدخل مكعب مجهر يحتوي على مقسم شعاع تمرير بطول 495 نانومتر في دائري وحدة المرآة داخل المجهر. قم بتركيب ذراع كشف يحتوي على غشاء مجال قابل للتعديل بمنفذ التركيب C للسماح باختيار منطقة الاهتمام ، وقم بإقران كاشف PMT وكاميرا USB بالمجهر. أدخل مكعب مرشح يحتوي على مقسم شعاع تمرير بطول 565 نانومتر ومرشح انبعاث 535/50 في منفذ PMT لتقسيم ضوء الانبعاث بين الكاشفين.

قم بإقران PMT بمصدر طاقة ومضخم PMT ، وقم بتوصيل إخراج مضخم PMT بدبوس إدخال تناظري لنظام الحصول على البيانات. للوفاء بمعايير Nyquist ومنع التعرج ، قم بتصفية البيانات التناظرية من PMT عند كيلو هرتز واحد أو أعلى ، ورقمنة البيانات بتردد لا يقل عن ضعف تردد أعلى تردد موجود في الإشارة التناظرية. لتحميل الخلايا بصبغة حساسة للجهد ، امزج خمسة ميكرولترات من 1000x FluoVolt و 50 ميكرولتر من محلول حمل الطاقة ، وأضف ثلاثة ميكرولترات من محلول التحميل الناتج إلى ثلاثة ملليلتر من محلول Tyrode الدافئ في طبق بتري.

أضف غطاء مغطى بالخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات المستحث إلى الطبق وضع الطبق على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. قم بتركيب غرفة تصوير الخلايا الحية الساخنة على مرحلة المجهر واملأ الغرفة ب 500 ميكرولتر من محلول Tyrode الطازج. ثم اغسل زلة الغطاء بمحلول Tyrode الطازج عند 37 درجة مئوية واستخدم ملقطا دقيقا لنقل زلة الغطاء بعناية إلى غرفة الحمام الدافئة مسبقا.

لتوحيد الديناميكيات الخلوية والمعلمات التجريبية ، أدخل قطبين من البلاتين في الغرفة ، متباعدة بخمسة ملليمترات ، وقم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بمحفز خارجي. اضبط المحفز على نبضات المجال ثنائية القطب بخمس مللي ثانية عند 0.5 هرتز ، وقم بزيادة الحافز من فولت واحد حتى تبدأ الخلايا في الانقباض. ثم اضبط الجهد على 25٪ تقريبا فوق هذه العتبة.

للحصول على إمكانات العمل البصري ، استخدم مسار الضوء المرسل وكاميرا USB لتصور الخلايا العضلية في ظل ظروف المجال الساطع. حدد خلية معزولة واستخدم الحجاب الحاجز الميداني لاقتصاص مسارها البصري بإحكام ، مما يضمن مراقبة الضوء فقط من الخلية ذات الاهتمام. قم بتنشيط مضخم PMT ، واضبط مصدر PMT على 750 فولت.

قم بتشغيل بروتوكول التحفيز جنبا إلى جنب مع برنامج الاستحواذ مع تنشيط ضوء الإثارة 470 نانومتر في نفس الوقت. سجل 10 عمليات مسح ، مما يضمن اكتشاف إمكانات عمل مستقرة. بعد المسح الأخير ، حرك مرحلة المجهر على الفور مع الاستمرار في التسجيل للحصول على إشارة خلفية لفترة وجيزة من منطقة خالية من الخلايا وإيقاف تشغيل ضوء الإثارة.

لتحليل بيانات الفعل المحتملة ، افتح تسجيلا محفوظا في برنامج التحليل المناسب وقم بمتوسط 10 عمليات مسح تحتوي على إمكانات عمل محفزة من خلية واحدة. اطرح متوسط إشارة خط الأساس التي تمثل إزاحة التألق من متوسط التتبع ، ثم استخدم الصيغة لحساب التغير في التألق باستخدام التألق الانبساطي ك F0. تحديد مجالات الاهتمام الانبساطي وإمكانات العمل وقياس معلمات إمكانات العمل القلبي المطلوبة ، بما في ذلك ، على سبيل المثال لا الحصر ، المدة عند 50٪ و 90٪ إعادة الاستقطاب. ثم قم بتصدير البيانات من هذه الخلية الفردية إلى برنامج جداول بيانات.

تسمح هذه الطريقة بالقياس الكمي السريع والدقيق لميكانيكا إعادة الاستقطاب ، والتي يمكن أن توفر رؤى قيمة للتشوهات الأيونية الخلوية. يمكن ملاحظة ميزات المرحلة الأولى الواضحة في الإشارات الضوئية من خلايا عضلة القلب في الفئران ، والتي تختلف شكليا عن تلك الموجودة في خلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان. بالإضافة إلى ذلك ، تستجيب خلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بالإنسان للتلاعب الدوائي باستخدام النيفيديبين ، وهو مضاد معروف لقناة الكالسيوم من النوع L.

أثناء الاستخدام المستمر للأدوية ، لوحظ انخفاض بنسبة 41.5٪ في مدة جهد الفعل عند إعادة الاستقطاب بنسبة 90٪ ، مما يشير إلى وظيفة التصوير القائم على مؤشر الجهد الفلوري كمنصة لدراسات فحص أدوية القلب عالية الإنتاجية المحتملة. من المهم أن تضع في اعتبارك أنه على الرغم من أن الصبغة الحساسة للجهد المستخدمة في هذه الدراسة أقل سمية للخلايا من غيرها ، إلا أنه لا يزال يتعين استخدام ضوء الإثارة باعتدال للحفاظ على جدوى الخلية. معدات القياس الضوئي المعدلية المستخدمة في هذا البروتوكول متعددة الاستخدامات بشكل لا يصدق.

على سبيل المثال ، يمكن استخدامه للقياسات المتزامنة لمعلمات الفيزيولوجيا الكهربية الأخرى ، مثل الكالسيوم داخل الخلايا.