الوقت تحليل التصوير الفلوري وتحليل غزو الخلايا السرطانية في نموذج 3D Spheroid

يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة الآليات التي تحكم غزو الخلايا السرطانية إلى المصفوفة خارج الخلية في الوقت الحقيقي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم جهاز تصوير كروي بسيط ، مما يجعل فحص غزو الزفو أسهل في إعداده ويحسن كفاءته وتكلفته. بينما نبرهن على استخدام فحص الغزو الزاوي لنموذج سرطان الثدي، هذا الفحص هو نموذج ممتاز لغزو أي ورم صلب في الأنسجة السليمة المحيطة.

بعد الطباعة 3D من المسافة، والوزن من نسبة 10:1 من البوليمر قاعدة إلى عبر رابط في كوب من البلاستيك واستخدام ماصة المتاح لخلط شامل الحل PDMS الناتجة في الكأس. وضع الكأس في غرفة فراغ والإفراج بسرعة عن ضغط الفراغ لإزالة أي الهواء المحاصرين على سطح الخليط وتبديد فقاعات الهواء المتبقية. احتضان 3D فراغ المطبوعة في 100 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لزيادة مرونته وتنظيف اثنين من لوحات الزجاج مع isopropanol 100٪.

ضع المسافة بحيث يكون تدفق بين اثنين من لوحات تنظيفها ووضع اثنين من مقاطع الموثق كبيرة على الحافة السفلية واحد على الزاوية العليا لختم القالب على الحواف الخارجية للألواح. فحص الجزء العلوي من القالب للتأكد من أن المسافة دافق مع لوحات الزجاج واستخدام ماصة المتاح مع ما يقرب من سنتيمترين قطع من طرف ببطء ولكن باستمرار إضافة خليط PDMS إلى الزاوية اليسرى العليا من القالب. عندما تم شغل القالب كله، ضع القالب في غرفة فراغ لإزالة أي فقاعات الهواء التي تشكلت، قبل علاج PDMS لمدة ساعة واحدة في 100 درجة مئوية.

في نهاية الحضانة، ضع القالب في درجة حرارة الغرفة. عندما يكون باردا لمسة، وإزالة مقاطع الموثق ولوحات الزجاج من المسافة التي تحتوي على PDMS الشفاء واستخدام شفرة حلاقة لقطع من خلال الختم الذي تم إنشاؤه على جميع الجوانب الأربعة للقالب بين المسافة والصحن الزجاجي. سحب بعيدا العفن للكشف عن ورقة PDMS في المسافة واستخدام ملاقط لتقشر بعناية ورقة PDMS قبالة من الفضاء.

ضع الورقة على حصيرة قطع واستخدم لكمة خزعة لكمة من قرص PDMS قطره 17.5 ملليمتر ، ثم لكمة ثلاثة موزعة بالتساوي 5.5 ملليمتر ثقوب في القرص. استخدم الشريط لإزالة أي جزيئات الغبار من كل إدراج والتمسك إدراج تنظيفها على قطعة من الشريط على الوجهين. التفاف الشريط حول غطاء طبق بيتري 10 سنتيمترا ووضع الغطاء في آلة البلازما جنبا إلى جنب مع فتح 35 ملليمتر الأطباق أسفل الزجاج.

قم بتنشيط الزاويات والزجاج مع دقيقة واحدة من المعالجة بالبلازما عند 300 ملليتورات واستخدم ملاقط لتعلق بسرعة الجانب المعالج من كل إدراج بالجزء الزجاجي من طبق قاع زجاجي معالج لكل إدراج. عندما تم تطبيق جميع إدراج، واستخدام الاصبع المؤشر والإبهام لتطبيق الضغط حتى على كل إدراج أثناء تدوير الطبق لإرفاق بشكل آمن إدراج إلى الأطباق. عندما تم تأمين جميع إدراج، احتضان أجهزة التصوير الزي الناتجة لمدة 20 دقيقة في 60 درجة مئوية، قبل إجراء جولة ثانية من العلاج البلازما كما هو موضح.

بعد العلاج الثاني، إضافة 35 ميكرولترات من حل طلاء الطازجة أعدت لكل ثقب إدراج. بعد ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، وإزالة الحل طلاء وشطف الجهاز ثلاث مرات مع الماء المقطر. بعد الغسيل الأخير، أضف 35 ميكرولترات من محلول الربط المتبادل لكل حفرة لاحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

في نهاية الحضانة ، شطف الجهاز ثلاث مرات بالماء المقطر كما هو موضح ، قبل ملء كل جهاز بنسبة 70 ٪ من الإيثانول لاحتضان لمدة 30 دقيقة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. في نهاية التعقيم ، شطف الأجهزة ثلاث مرات بالماء المقطر وإضافة 2.5 ملليلتر من محلول التخزين إلى كل جهاز. لتضمين الـ spheroids في الكولاجين، اغسل الأجهزة ثلاث مرات بثلاثة ملليلترات من PBS لكل غسل.

بعد الغسيل الأخير، والسماح للأجهزة لتجف تماما، قبل إضافة واحد spheroid في 30 ميكرولترات من الكلية الطازجة أعدت حل واحد في حفرة واحدة من إدراج وبدء جهاز توقيت. بعد التأكد من وجود spheroid في الحفرة، إضافة spheroids إلى الثقوب الأخرى اثنين كما هو موضح. استخدام تلميح ماصات ميكرولتر 10 إلى أحدث أي spheroids التي تقع بالقرب من حدود PDMS أو لفصل spheroids إذا تم توزيع متعددة spheroids وإيقاف المؤقت.

لمركز الزفيرويد عموديا في طبقة الكولاجين، بعد البذر، الوجه الجهاز رأسا على عقب واحتضان الجهاز في 37 درجة حتى الكولاجين البلمرة، وعكس اتجاه الجهاز كل دقيقتين لما مجموعه 30 دقيقة، ثم إضافة 2.5 ملليلتر من المتوسط لكل جهاز والحصول على صورة من spheroids في نقطة ساعة الصفر. إن استخدام جهاز الصورة الزنجي يسهل عملية التضمين الفعال وتسجيل الفاصل الزمني لغزو الخلايا السرطانية داخل الكولاجين أو عن طريق التصوير الطولي. في حين تم تصوير هذا الزفيودي طوليا على مدى ستة أيام تتطلب التعبير مستقرة من البروتينات الفلورية السيتوبلازمية و / أو النووية، ويمكن إجراء تصوير طولي مماثل على مدى فترة زمنية أقصر باستخدام وضع العلامات صبغ.

يمكن أيضا أن تكون ثابتة وsoidoids. على سبيل المثال، تم تسمية هذه الزفيرويدات المناعية للكادهرين الظهارية، الكوركتين، وF-actin. في هذه الصور، يمكن ملاحظة توضيح خطوة بخطوة لإجراء معالجة الصور باستخدام ماكرو فيجي لقياس مساحة الزفير مع مرور الوقت.

تأكد من الاستغناء عن واحد كروي في كل ثقب من جهاز التصوير spheroid ووضعها في مركز الثقب في كل من الاتجاهات س ص و Z. يمكن بسهولة تعديل تصميم الجهاز عن طريق تغيير حجم وترتيب الثقوب ، وإدراج ، والأطباق أسفل الزجاج لاستيعاب إنتاجية أعلى spheroid.