فحص محسن وأدوات لقياس النوسسيبل الميكانيكي في يرقات دروسوفيليا

هذا البروتوكول مهم لأنه يسمح للمستخدم ببناء أداة يمكن استخدامها لقياس استجابات الألم الميكانيكية بدقة في يرقات ذبابة الفاكهة القابلة للتتبع وراثيا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم مواد بسيطة لبناء أدوات مخصصة يمكن استخدامها لقياس الشعور بالألم الميكانيكي من العتبة الفرعية إلى النطاق المستجيب بالكامل. يمكن استخدام هذه الأدوات والأساليب لقياس الشعور بالألم الميكانيكي الأساسي والحساسية العاطفية بعد الإصابة أو المرض.

فحص اليرقات بخيوط مخصصة ممارسة. يجب أن يكون المستخدمون قادرين على إنشاء منحنيات استجابة الجرعة مع يرقات التحكم قبل محاولة إجراء تجربة. لبناء مسبار ميكانيكي ، استخدم قاطع سلك صغير لقطع كل خيوط نيتينول بالطول المحدد عموديا على محورها الطويل.

تأتي الخيوط بثلاثة أقطار مختلفة محددة مسبقا. افحص طرف الخيوط تحت مجهر استريو للتأكد من عدم وجود حواف حادة أو غير منتظمة يمكن أن تسبب تلف الأنسجة لجلد اليرقة وتتداخل مع المعايرة. ثم استخدم حجر شحذ لتنعيم حواف المسبار يدويا حتى لا تستمر المخالفات الحادة.

بعد ذلك ، استخدم إبرة تحت الجلد لعمل ثقب بالقرب من نهاية عصا المصاصة الخشبية. ضع غراء الخشب على خيوط نيتينول واحدة وأدخل الفتيل المطلي بالغراء في فتحة الإبرة. عندما يجف الغراء ، اضغط على المسبار على المقياس حتى ينحني المسبار لتحديد القوة القصوى التي يمكن تسجيلها بالجرام.

استخدم الصيغة لتحويل الكتلة المسجلة إلى قوة بالمللي نيوتن. ثم اقسم القوة المقاسة على مساحة سطح طرف الفتيل لتحويل القوة المحسوبة إلى كيلو باسكال من الضغط. سيؤدي إعداد مجسات متعددة باستخدام خيوط بأقطار وأطوال مختلفة إلى إنشاء مجموعة كاملة ، تمتد على نطاق الاستجابة ليرقات ذبابة الفاكهة.

لتحضير يرقات ذبابة الفاكهة للتجربة ، قم بتربية ذرية اليرقات على الطعام القياسي في حاضنة 25 درجة مئوية لمدة 96 ساعة تقريبا. عندما تصل اليرقات إلى مرحلة الطور الثالث ، قم بإعداد سدادة من طعام الذباب في طبق بتري صغير لليرقات لاختبارها واستخدم الملقط لفرز يرقات الطور الثالث المتوسطة الحجم برفق من الطور الثاني الأصغر وأوائل الطور الثالث ويرقات الطور الثالث المتأخرة أو المتجولة. ثم استخدم الملقط لنقل 20 إلى 30 يرقات في منتصف الطور الثالث إلى طبق بتري صغير يحتوي على سدادة صغيرة من طعام الذباب المبلل بالماء في درجة حرارة الغرفة.

لإجراء فحص ميكانيكي للألم ، استخدم الملقط لوضع يرقة منتصف الطور الثالث على وسادة فينيل رقيقة داكنة تحت مجهر ستيريو برايتفيلد وترتيب أضواء الألياف الضوئية بين العدسات الموضوعية المجهرية والوسادة. استخدم منشفة ورقية لمسح أي ماء زائد يحيط باليرقة وحرك الوسادة لتوجيه رأس وفم اليرقة نحو اليد غير المهيمنة للباحث. حدد مسبارا ميكانيكيا وقم بتطبيق المسبار على الجانب الظهري الخلفي لليرقة عند الجزء البطني A8 تقريبا لمدة ثانية إلى ثانيتين ، وضغط اليرقة بعناية في الوسادة الأساسية عند نقطة ملامسة المسبار حتى ينحني المسبار ويخرج مقدار الضغط المقاس مسبقا.

يشار إلى استجابة إيجابية للألم إذا أظهرت اليرقة لفة مفتاح كاملة بزاوية 360 درجة على طول محور جسمها في غضون ثلاث ثوان. سجل الاستجابة السلوكية لكل يرقة. ثم تخلص من اليرقة المختبرة وقم بإعداد اليرقة التالية للمقايس.

يمكن استخدام هذه المجسات الميكانيكية المخصصة مع خيوط النيتينول لاستنباط السلوكيات التي يتم استثارتها ميكانيكيا ولتوليد منحنى سلوكي كامل للجرعة والاستجابة باستخدام مجسات ميكانيكية غير ضارة وضارة متفاوتة الشدة. كما توضح نتائج الفحص السلوكي هذه ، فإن المجسات التي تمارس ضغطا يبلغ 200 كيلو باسكال أو أقل لا تثير استجابة مكرونة في ذبابة الفاكهة يرقات. كما هو متوقع ، فإن هذه المجسات الميكانيكية دون العتبة أو غير الضارة لا تثير تلفا مرئيا في الأنسجة العصبية.

على العكس من ذلك ، فإن العتبة الفائقة أو المجسات الضارة تثير استجابة سلوكية معززة بالإضافة إلى تلف الأنسجة للخلايا العصبية الحسية المحيطية نفسها بطريقة تعتمد على الجرعة. يمكن أيضا استخدام هذه المجسات لقياس فرط الحساسية الميكانيكية بعد الإصابة. يستجيب ما يقرب من 20٪ من اليرقات مع التدحرج البغيض في وقت مبكر يصل إلى ساعتين بعد العلاج بالأشعة فوق البنفسجية ، بينما استجابت 50٪ أربع ساعات مقارنة بالحيوانات الوهمية للأشعة فوق البنفسجية.

نظرا لأن المسبار المستخدم في هذا التحليل كان عادة عتبة فرعية 200 كيلو باسكال ، فقد اعتبرت هذه الاستجابة ألودينيا ميكانيكية. في نقاط زمنية لاحقة ، تزداد الاستجابة السلوكية لليرقات المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية بشكل طفيف ولكنها لا تختلف إحصائيا عن تلك الخاصة بمجموعة التحكم المشععة الوهمية. تظهر اليرقات التي تم فحصها بمسبار 462 كيلو باسكال في أربع وثماني و 16 ساعة بعد العلاج بالأشعة فوق البنفسجية زيادة كبيرة في الاستجابة المتداول المكروهة مع أربع ساعات كونها ذروة فرط الحساسية السلوكية حيث كان الحافز ضارا في البداية.

اعتبرت الاستجابة فرط الألم الميكانيكي. يعد تحضير المسبار واختيار اليرقة وضغطها أمرا بالغ الأهمية لنجاح العملية. باستخدام هذه المجسات جلبت خط الأساس يمكن قياس فرط الحساسية الميكانيكية للألم بعد الإصابة.

باستخدام هذه الأدوات والمقايسة ، يمكن قياس الأسس الجزيئية والوراثية لشعور الألم الميكانيكي وفرط الحساسية للألم في نموذج ذبابة الفاكهة القابل للتتبع وراثيا.