تمايز الخلايا السليفة العصبية الناجمة عن الحقل الكهربائي في الأجهزة الدقيقة
أبريل 14, 2021
في هذه الدراسة، نقدم بروتوكولا لتمايز الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلف (NPCs) الناجمة فقط عن التحفيز المباشر لنبض التيار (DC) في نظام ميكروفلويديك.
تقدم هذه الدراسة بروتوكولا لتمايز خلايا السلائف العصبية الناجمة فقط عن التحفيز المباشر للنبض الحالي في نظام ميكروفلويديك. توفر هذه التقنية أسلوب مفيد لتقليل وقت الإعداد التجريبي وحجم العينة وحجم الكاشف. وعلاوة على ذلك، فإن رقاقة MOE مناسبة لملاحظات المجهر البؤري.
يمكن لعلاج النبض الحالي المباشر البسيط التحكم في مصير خلايا السلائف العصبية للفأر ويمكن استخدامه لتطوير استراتيجيات علاجية لاضطرابات الجهاز العصبي. للبدء، رسم أنماط لطبقات PMMA الفردية والشريط على الوجهين باستخدام البرامج المناسبة. قم بتشغيل كاتب ليزر ثاني أكسيد الكربون وتوصيله بجهاز كمبيوتر شخصي.
افتح ملف النقش المصمم باستخدام البرنامج. ضع أوراق PMMA أو الشريط على الوجهين على منصة كاتب الليزر ، ثم ركز الليزر على سطح أوراق PMMA أو الشريط على الوجهين باستخدام أداة التركيز التلقائي. حدد كاتب الليزر كطابعة، ثم استخدم كاتب الليزر لبدء الاستئصال المباشر على ورقة PMMA أو الشريط على الوجهين.
إزالة الفيلم واقية من أوراق PMMA وتنظيف السطح باستخدام غاز النيتروجين. للترابط معا طبقات متعددة من أوراق PMMA، كومة ثلاث قطع من أوراق PMMA ملليمتر واحد والسندات لهم تحت ضغط من خمسة كيلوغرامات لكل سنتيمتر مربع في عبودية الحرارية لمدة 30 دقيقة في 110 درجة مئوية لتشكيل تدفق أو تجميع قناة التحفيز الكهربائي. الالتزام 12 قطعة من المحولات إلى فتحات الفردية في طبقة واحدة من التجمع رقاقة وزارة التربية والتعليم مع الغراء سيانواكريلات سريع التمثيل.
تطهير ركائز PMMA ملليمتر واحد، الشريط على الوجهين، وثلاثة ملليمترات الصف البصري PMMA باستخدام الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة قبل تجميع رقاقة. الالتزام PMMA ملليمتر واحد ركائز على درجة بصرية ثلاثة ملليمتر PMMA مع الشريط على الوجهين لإكمال التجميع PMMA. الالتزام coverglass تنظيفها إلى التجمع PMMA مع الشريط على الوجهين.
ختم فتحات محولات جسر أجار مع المقابس البيضاء إصبع ضيق. قم بتوصيل الموصل السفلي المسطح بتجميع شرائح MOE عبر المحولات المتوسطة للمدخل والمأخذ، ثم قم بتوصيل محول مخروط Luer ب stopcocks الثلاثية. إضافة اثنين من ملليلتر من محلول PLL 0.01٪ باستخدام حقنة ثلاثة ملليلتر الذي يربط إلى stopcock ثلاثية من مدخل المتوسطة، وربط حقنة فارغة ثلاثة ملليلتر إلى stopcock ثلاثية من منفذ المتوسطة.
ملء مناطق ثقافة الخلية مع حل PLL، وضخ ببطء حل الطلاء ذهابا وإيابا. أغلق الحطابين الثلاثيين لإغلاق الحل داخل مناطق الثقافة. احتضان رقاقة MOE في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها في حاضنة مليئة 5٪ من الغلاف الجوي لثاني أكسيد الكربون.
فتح stopcocks ثلاثية اثنين وطرد فقاعات بعيدا في القنوات عن طريق ضخ يدويا حل الطلاء ذهابا وإيابا في القناة باستخدام الحقن اثنين. رسم ثلاثة ملليلتر من المتوسطة كاملة في حقنة ثلاثة ملليلتر الذي يربط إلى stopcock ثلاثية من مدخل المتوسطة وإضافته ليحل محل حل الطلاء في مناطق ثقافة الخلية. استبدل قابس الإصبع الأبيض بمحول Luer واضخ 3٪ من الآغروز الساخن لملء المحول.
قم بتوصيل حقنة قفل Luer بمحول Luer وحقن 3٪ من الآغروز الساخن من خلال بونغ المطاط الأسود لملء حقنة قفل Luer. السماح 10 إلى 20 دقيقة لgarose لتهدئة وترسيخ. تثبيت رقاقة MOE المصنف الخلية على سخان ITO شفافة التي يتم تثبيتها على مرحلة XYZ الآلية للبرمجة الحفاظ على 37 درجة مئوية.
غرس mNPCs عن طريق ضخ يدويا في رقاقة وزارة التربية والتعليم عبر منفذ المتوسطة، ثم احتضان رقاقة MOE الخلايا المصنف على سخان ITO لمدة أربع ساعات. استخدم الأسلاك الكهربائية لتوصيل جهاز EF متعدد الأجهزة بشريحة MOE عبر الأقطاب الكهربائية على الشريحة. قم بتوصيل متعدد EF ومولد دالة بمضخم للصوت لإخراج نبضات DC الموجة المربعة.
قم بإزالة كل الموصل السفلي المسطح والمحولات الموجودة على شريحة MOE وملء المحولات ب PBS، ثم قم بإغلاق فتحات المحول باستخدام parafilm. بعد الالتهاز المناعي، لاحظ الخلايا باستخدام مجهر مضان كونفوكال. أدى تحفيز نبض DC إلى تمييز ال MNPCs المتزامنة إلى خلايا عصبية وخلايا أستراتية وخلايا أوليغودندروسيت في وسط صيانة الخلايا الجذعية.
تظهر النسب المئوية للخلايا العصبية والخلايا الفلكية وخلايا أوليغودندروسيت في مجموعة التحكم وفي مجموعة التحفيز هنا. بعد علاج نبض DC ، أعربت ال MNPCs عن أعداد كبيرة من الخلايا العصبية في DIV Seven ، والخلايا الفلكية في DIV ثلاثة ، وكانت خلايا أوليغودندروسييتس في DIV Seven و DIV 14 موجودة عند مستويات أعلى نسبيا في مجموعات التحفيز مما كانت عليه في مجموعة التحكم. ويفضل الخلايا العصبية التي شكلتها 30 إلى 40 خلية لبدء التمايز mNPC.
فرط نمو ال MNPCs سيضعف بقاء الخلية أثناء عملية التمايز.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولاً لتمايز الخلايا السليفة العصبية المحفزة بواسطة نبضات التيار المستمر في نظام مائعي دقيق. وتعمل هذه التقنية على تقليل وقت إعداد التجربة، وحجم العينة، وكمية الكواشف، مما يجعلها فعالة في التطبيقات البحثية.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- الموائع الدقيقة
خلفية علمية
- تُعد الخلايا العصبية السلفية (NPCs) بالغة الأهمية لفهم التطور العصبي.
- يمكن لتحفيز نبضات التيار المستمر أن يؤثر على مصير الخلية.
- تسمح الأنظمة المائعية الدقيقة بالتحكم الدقيق في الظروف التجريبية.
- يمكن لهذا النهج أن يساعد في تطوير علاجات لاضطرابات الجهاز العصبي.
الغرض من الدراسة
- وضع بروتوكول موثوق لتمايز الخلايا السلفية العصبية (NPC).
- استخدام تحفيز التيار المباشر كوسيلة للتحكم في مصير الخلايا.
- إثبات فعالية نظام الموائع الدقيقة في أبحاث العلوم العصبية.
الطرق المستخدمة
- تصميم أنماط لطبقات PMMA والشريط اللاصق مزدوج الوجه.
- استخدام جهاز نقش بالليزر وثنائي أكسيد الكربون للتصنيع.
- تطبيق تحفيز بنبضات التيار المستمر على الخلايا العصبية السلفية (NPCs).
- إجراء ملاحظات مجهرية بؤرية (confocal microscopy) للتحليل.
النتائج الرئيسية
- التمايز الناجح للخلايا السلفية العصبية (NPCs) باستخدام البروتوكول المقترح.
- تقليل الوقت المستغرق في الإعداد التجريبي واستهلاك الموارد.
- جدوى استخدام شريحة MOE في الفحص المجهري.
- التطبيقات المحتملة في الاستراتيجيات العلاجية لاضطرابات الجهاز العصبي.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول نهجاً مبسطاً لتمايز الخلايا السلفية العصبية (NPC).
- يعد التحفيز بالتيار المستمر فعالاً في التحكم في مصير الخلايا.
- تعزز الأنظمة الموائع دقيقة (Microfluidic systems) الكفاءة التجريبية في علوم الأعصاب.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تتيح هذه المنصة الموائع دقيقة التحكم الدقيق في تمايز الخلايا السلفية العصبية باستخدام تحفيز نبضي بالتيار المستمر، مما يوفر نموذجاً قابلاً للتوسع وفعالاً في استهلاك الموارد للتحقق من الأهداف في أبحاث الأمراض التنكسية العصبية. ومن خلال تقليل التعقيد التجريبي واستهلاك الكواشف، تدعم هذه المنصة تقليل المخاطر الميكانيكية في المراحل المبكرة وتعزز الثقة التنبؤية في استراتيجيات تعديل مصير الخلايا. إن توافق النظام مع التحفيز طويل الأمد والتصوير الآلي يجعله مهيأً للدمج في سير عمل الاكتشافات التي تركز على علاجات الجهاز العصبي.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يتيح استقصاء الإشارات الكهربائية كمنظمات لمصير الخلايا السلفية العصبية، مما يدعم اختبار الفرضيات المستهدفة في مسارات التطور العصبي.
- القيمة التشغيلية: يقلل من أحجام العينات والكواشف من خلال الحصر الموائع الدقيقة، مما يخفض التكاليف في حملات الفحص المبكر للأهداف.
- القيمة التنبؤية: يوفر قراءات كمية للتمايز العصبي، والتمايز النجمي، وتمايز الخلايا الدبقية قليلة التغصن، مما يتيح اتخاذ قرارات مبنية على البيانات بالاستمرار أو التوقف بشأن الأهداف التعديلية.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يُنتج مخرجات تمايز معيارية وقابلة للتكرار تحت بارامترات مجال كهربائي مضبوطة، مما يجعله مناسباً لتحسين المقايسات.
- القيمة التشغيلية: يسهل اختبار ظروف متعددة عبر تصميمات تعتمد على القنوات، مما يزيد من الإنتاجية في تقييم المركبات أو المحفزات.
- جاهزية المقايسة: يدعم الزراعة طويلة الأمد والتصوير بفاصل زمني، مما يتيح التوصيف الحركي لديناميكيات التمايز من أجل التحقق من صحة المقايسة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الترجمية: يستخدم خلايا عصبية سلفية من الفئران في بيئة دقيقة محددة، مما يعزز الصلة بعمليات التمايز العصبي داخل الجسم الحي.
- النمذجة قبل السريرية: يدعم توليد السلالات الدبقية والعصبونية من سلف مشترك، وهو أمر مفيد لنمذجة اضطرابات الجهاز العصبي.
- التقدم المعدل حسب المخاطر: يتيح تقييم انحياز التمايز تحت التحفيز، مما يوفر معلومات حول توصيف السلامة والفعالية الميكانيكية.
تكامل مسارات العمل والتدفقات الإجرائية
تندرج هذه الطريقة ضمن سلسلة الاكتشافات المبكرة، لا سيما في مرحلتي التحقق من الهدف وتحديد المركبات الرائدة، حيث يكون الفهم الآلي لمنظمات مصير الخلية أمراً بالغ الأهمية. كما أنها تدعم حملات الفحص من خلال توفير نظام محكوم وقابل للقياس لتقييم النشاط البيولوجي للمعدلات الكهربائية أو الدوائية. وتغذي مخرجات هذه المنصة — المتمثلة في مقاييس التمايز الخاصة بالسلالة — مسارات التحليل المستخدمة لتحديد أولويات الأهداف بثقة تنبؤية في آليات الإصلاح العصبي.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات حول مسارات الإشارات الكهربائية الحيوية في الخلايا السلفية العصبية، مما يقلل من الغموض في الآلية المستهدفة.
- الفحص: يتيح إجراء مقايسات تمايز كمية وقابلة للتكرار تحت تحفيز كهربائي محدد، مما يحسن من موثوقية المقايسة.
- التحليلات: يوفر نقاط نهاية قابلة للقياس (على سبيل المثال، % neurons، astrocytes، oligodendrocytes) للتحليل المقارن عبر الظروف المختلفة.
- البحث الانتقالي: ينمذج ديناميكيات التمايز ذات الصلة باضطرابات الجهاز العصبي، مما يدعم الاستمرارية في المرحلة قبل السريرية.
- إعادة الاستخدام في المؤسسات: مصمم للاستخدام المتكرر عبر ظروف تجريبية متعددة، مما يعزز التقييس والاتساق بين المشاريع المختلفة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزز الثقة في التحقق من صحة الهدف من خلال عزل التحفيز الكهربائي كمتغير محدد في تحديد مصير الخلية.
- القيمة التشغيلية: توحد بروتوكولات التمايز من خلال دقة الموائع الدقيقة، مما يحسن إمكانية تكرار النتائج عبر المواقع والفرق المختلفة.
- القيمة الاستراتيجية: تسرع قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال توفير قراءات ميكانيكية مبكرة حول الالتزام بالسلالة الخلوية، مما يقلل من مخاطر الفشل في المراحل المتأخرة.
- التأثير على المحفظة: تتيح تحديد أولويات الأهداف التي تعدل التمايز العصبي وفقاً للمخاطر، مما يحسن كفاءة رأس المال في محافظ علوم الأعصاب.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تجميع الأجهزة الموائعية الدقيقة، وعلم الفيزيولوجيا الكهربائية، وزراعة الخلايا الجذعية العصبية.
- يعتمد على توفر أدوات التصنيع بالليزر، وسخانات ITO، ومضاعفات EF، وأنظمة المجهر المقلوب.
- يستلزم توحيد المعايير للمعلمات الكهربائية (عرض النبضة، والتردد، والسعة) عبر التجارب لضمان نتائج قابلة للتكرار.
- قد يتطلب التكيف مع الخلايا السلفية العصبية المشتقة من البشر تحسين معلمات التحفيز وظروف الزراعة.
- تمثل استقرارية الأقطاب الكهربائية على المدى الطويل والتلوث الحيوي في دراسات التحفيز المزمن قيوداً عملية يجب مراعاتها.
الأسئلة الشائعة حول الأدوية الحيوية
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:46
Design and Fabrication of the Multichannel, Optically Transparent, Electrotactic Chip and Coating Poly-L-lysine on the Substrate in the Cell Culture Regions
2:49
Coating Poly-L-lysine on the Substrate in the Cell Culture Regions and Preparation of the Salt Bridge Network
4:47
Setup of the Microfluidic System for DC Pulse Stimulation
5:55
Results: Differentiation of the mNPC Cells in the Control Group and in the DC Pulse Stimulation Group at DIV 3, 7, and 14
6:43
Conclusion
