تشريح المخيخ الإقليمي للتحليل الجزيئي

تم إجراء الدراسات الجزيئية التقليدية للمخيخ على مستخلصات المخيخ الكاملة ، والتي قد تخفي أي فروق عبر مناطق مخيخية معينة. يتيح هذا البروتوكول تقييم مناطق متميزة من المخيخ بشكل منفصل ويسمح باستكشاف الآليات الجزيئية التي قد تكمن وراء مساهماتها الفريدة في سلوكيات متنوعة وتطور المرض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتشريح السريع والقابل للتكرار لأربع مناطق مخيخية ، النوى المخيخية العميقة ، القشرة المخيخية الأمامية والخلفية للفيرمية والقشرة المخيخية في نصفي الكرة الأرضية.

بعد قطع رأس الفأر القتل الرحيم ، قم بعمل شق بشفرة حلاقة على طول الخط السهمي الإنسي للرأس ، بدءا من الأنف واستمر على طول طريق العودة. افصل الجلد واستخدم شفرة الحلاقة لقطع العضلات على كل جانب ، وقطع قنوات الأذن خلفها. باستخدام مقص تشريح ، قم بقص العديد من مناطق الحبل الشوكي حتى حيث يلتقي جذع الدماغ بالمخيخ ، مع الحرص على عدم إتلاف

أدخل إحدى شفرات مقص الأوعية الدموية في الفراغ بين جذع الدماغ والعمود الفقري واقطعها باتجاه قناة الأذن ، مع رفعها لأعلى أثناء القطع للحد من تلف الأنسجة. استمر في القطع على طول حافة الجمجمة لأعلى باتجاه المصابيح الشمية. باستخدام الملقط غير الحاد ، انزع الجزء الخلفي من هذه الجمجمة برفق للكشف عن المنطقة الخلفية من الدماغ والمخيخ.

ضع الملقط الحاد على طول الحافة المقطوعة للجمجمة وقشر الجمجمة لأعلى وفوق الدماغ. قم بقص باقي الجمجمة بمقص الأوعية الدموية والملقط الحاد ، وقم بإزالة معظمها من أعلى الدماغ. ارفع الدماغ قليلا باستخدام الملعقة الدقيقة لإزالة البصيلات الشمية من الجمجمة المتبقية وفصل ألياف الجهاز البصري.

يجب أن يتحرر الدماغ بسهولة في هذه المرحلة. ضع الدماغ في طبق بتري ، واجلس على الجليد وقم بإزالة أي جمجمة متبقية أو حطام آخر. ضع الدماغ برفق في مصفوفة الدماغ مع الجانب الظهري لأعلى.

تأكد من أنه تم ضبطه على مستوى في المصفوفة وأن خط الوسط في المنتصف. ضع شفرة حلاقة واحدة على طول خط الوسط السهمي ، وتأكد من أن الشفرة تدفع على طول الطريق إلى أسفل المصفوفة. ضع شفرة حلاقة أخرى ملليمتر واحد على جانب الشفرة الأولى.

ضع شفرتين أخريين ينتج عنه ثلاث شفرات موضوعة على جانب واحد من الدماغ ، على بعد ملليمتر واحد. كرر هذا على الجانب الآخر. أمسك بعناية الواجهة الأمامية والخلفية لشفرات الحلاقة ، وارفعها بشكل مستقيم خارج المصفوفة.

تخلص من الأنسجة الموجودة على السطح الخارجي لشفرات الحلاقة. ببطء ، افصل شفرة حلاقة واحدة في كل مرة عن الآخرين مع الحرص على عدم إتلاف أقسام الأنسجة. حرك قسم المناديل من شفرة الحلاقة على الشريحة الزجاجية باستخدام الملعقة الدقيقة.

يجب جمع ستة أقسام دماغية سهمية. سيكون للأقسام الجانبية الأولى DCN مرئية. لعزل DCN، أمسك طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر بشكل عمودي فوق DCN وادفعه لأسفل عبر الأنسجة المتأرجحة بقوة في جميع الاتجاهات.

ارفع الماصة لأعلى وتأكد بصريا من وجود الأنسجة في الحافة. ضع إصبعا واحدا في الجزء العلوي من الطرف وادفعه لأسفل ، مما يتسبب في انتفاخ الأنسجة. أدخل الطرف في أنبوب ميكروفيش مسمى بشكل صحيح وتأكد من وضع ثقب الأنسجة في قاع الأنبوب.

كرر هذا للأقسام الثلاثة المتبقية ، مع وضع لكمات DCN في نفس الأنبوب. فلاش تجميد الأنبوب في النيتروجين السائل. ادفع باقي أنسجة المخ حول المخيخ في الأقسام التي تم استخراج DCN فيها.

استخدم ملقطا غير حاد لالتقاط أقسام القشرة المخيخية في نصف الكرة الأرضية برفق ووضعها في أنابيب الميكروفيش الخاصة بها ، ثم قم بتجميدها بسرعة. بالنسبة للقسمين المثاليين الأخيرين ، ادفع أنسجة المخ المحيطة بعيدا لتترك المخيخ فقط. باستخدام شفرة حلاقة ، قم بعمل قطع يفصل الشفرين الأماميين عن الشفرين الخلفيين.

تأكد من أن القطع بعد تكوين ستة شفتين مباشرة ولا يشمل 10 الشفرين. باستخدام ملقط حاد ، ضع بعناية أقسام القشرة المخيخية الأمامية وأقسام القشرة المخيخية الخلفية في أنابيب الميكروفيش الخاصة بها وقم بتجميدها بالفلاش عن طريق ترك الأنابيب في النيتروجين السائل لمدة خمس دقائق. ضع أنابيب الميكروفيش على الجليد لمنع الأنسجة من الذوبان بسرعة كبيرة وقم بتطبيق 150 ميكرولترا من محلول عزل الحمض النووي الريبي البارد في أنبوب الميكروفيش ، ثم تجانس بمدقة معقمة.

بمجرد تجانس الأنسجة، قم بتحريك المحلول لأعلى ولأسفل لضمان عدم وجود أنسجة سليمة متبقية. علاوة على ذلك ، قم بتفتيت أي قطع صغيرة من الأنسجة عن طريق سحبها إلى حقنة الأنسولين عدة مرات. أضف 350 ميكرولترا أخرى من الكاشف ، وقم برفع الماصة لأعلى ولأسفل لخلطها جيدا واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

أضف 150 ميكرولترا من الكلوروفورم إلى الأنبوب ورجها بقوة ، ثم اتركه يرتاح لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. جهاز طرد مركزي عند 12 ، 000 مرة جم عند 15 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بإزالة الأنابيب بعناية من جهاز الطرد المركزي واضبط درجة حرارة جهاز الطرد المركزي على أربع درجات مئوية.

انقل الطور المائي الصافي فقط إلى أنبوب جديد ، مع الحرص على عدم تعطيل الطور البيني غير الشفاف. احفظ أو تخلص من المحلول المتبقي في الأنابيب. أضف 100٪ كحول الأيزوبروبيل بنسبة واحد إلى اثنين واخلطه جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.

دع العينة ترتاح في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لترسيب الحمض النووي الريبي خارج المحلول. جهاز طرد مركزي عند 12 ، 000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، مع وضع جميع الأنابيب في نفس الاتجاه لتسهيل تصور الحبيبات. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة الأنابيب بعناية وإزالة المادة الطافية باستخدام الماصة ، مع التأكد من عدم تعطيل الحبيبات.

الحبيبات تشبه الهلام ويصعب رؤيتها ، لذا قم بتقدير المكان الذي تستند إليه بناء على اتجاه الأنابيب في جهاز الطرد المركزي. بعد إزالة كل المواد الطافية ، أضف 500 ميكرولتر من 75٪ من الإيثانول ، والدوامة لفترة وجيزة وأجهزة الطرد المركزي عند 7 ، 500 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة الطافية بعناية ، دون تعطيل الحبيبات.

اترك الأغطية مفتوحة لتجفيف العينة لمدة خمس إلى 10 دقائق. بمجرد أن تجف ، أعد تعليق الحبيبات في الماء الحر للحمض النووي عند 20 ميكرولتر لعينات DCN و 30 ميكرولتر لجميع الآخرين. قم بتخزين العينات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى مزيد من التحليل.

تم استخدام هذا البروتوكول لتشريح أربع مناطق متميزة من مخيخ الفأر واستكشاف الاختلافات الإقليمية في التعبير الجيني. تم تقييم مستويات التعبير عن Aldolase C و parvalbumin و KCNG4 باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي. يتم التعبير عن Aldolase C بشكل أكبر في الدودة المخيخية الخلفية.

ولكن أقل في DCN والمنطقة الأمامية من الدودة عند مقارنتها بتسلخ المخيخ السائب. يوجد بارفالبومين بالمثل في الدودة الأمامية DCN والديدان الخلفي والقشرة المخيخية في نصف الكرة الأرضية ، عند مقارنتها بالمستخلصات المخيخية السائبة. يتم إثراء KCNG4 بشكل كبير في DCN والفيرم الداخلي ، ولكن ليس في الدودة الخلفية أو نصفي الكرة الأرضية عند مقارنتها بالاستخراج السائب.

لمقارنة تعبير الألدولاز C مباشرة عبر القشرة المخيخية ، تمت مقارنة مستويات التعبير بالديدان الأمامي. كان مستوى التعبير عن ألدولاز سي أعلى بشكل ملحوظ في الدودة الخلفية ويتجه إلى أعلى في نصفي الكرة المخيخية. يمكن أيضا استخدام الحمض النووي الريبي المستخرج من هذه المناطق في تسلسل الحمض النووي الريبي والتجارب.

ستوفر سلسلة الحمض النووي الريبي التي تقارن هذه المناطق المخيخية معلومات أكثر تفصيلا حول الآليات الجزيئية ، والوظائف المنفصلة الأساسية لهذه المناطق. بالإضافة إلى الاختلافات المحتملة في تعرضهم للمرض.