في المختبر الوقت الفاصل التصوير بالخلايا الحية لاستكشاف هجرة الخلايا نحو جهاز كورتي

تتضمن الطريقة الموجودة في المختبر للتحقيق في هجرة الخلايا الجذعية الجذعية بروتوكولات Transwell أو التئام الجروح. يمكن استخدام الطريقة الموضحة هنا لتتبع ترحيل الخلايا الجذعية الجذعية للاستنساخ في الوقت الفعلي. من حيث ثقافة المصنع ، فإن ميزة هذه الطريقة مقارنة بالطرق الأخرى هي أنها تحقق انخفاضا في الوقت والتكلفة ، فضلا عن تبسيط الخطوات التجريبية.

يمكن استخدام هذه التقنية لمراقبة توجيه الخلايا الجذعية للاستهداف في الوقت الفعلي مما يؤدي إلى تطوير نماذج ذات كفاءة توجيه محسنة. إزالة الغشاء الصدري أمر صعب على الباحثين عديمي الخبرة. اعتمادا على مرحلة التطوير ، يعد فهم الوقت المناسب لإزالة الغشاء الصدري أمرا مهما لنجاح هذا البروتوكول.

سيوضح الإجراء الدكتور جيونغ أون بارك و Dr.Su هون لي ، أساتذة باحثين من مختبري. ابدأ بتعقيم غطاء مزرعة الأنسجة ذات التدفق الصفحي عن طريق تشغيل الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة تقريبا. رش جميع الأسطح بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل الاستخدام واتركها حتى تجف.

ضع أدوات التشريح في 70٪ من الإيثانول لمدة 10 دقائق ، ثم جففها قبل الاستخدام. بعد قطع رأس فأر عمره ثلاثة إلى أربعة أيام ، انقع الجزء الأمامي في 70٪ من الإيثانول وضعه تحت مجهر تسلسلي في غطاء التدفق الرقائقي. انقع الأنسجة بسرعة في محلول تشريح الأنسجة لإزالة الإيثانول.

اقطع الخط المركزي للجمجمة بالشفرة الجراحية ، ثم كشف الجمجمة عن طريق سحب الجلد إلى الأمام وقطع القناة السمعية الخارجية للأذن. اقطع من الجزء الأمامي إلى الخلفي من الجمجمة عبر خط العين ، ثم افتح الجمجمة وقم بإزالة الدماغ الأمامي والمخيخ وجذع الدماغ باستخدام ملقط حاد. باستخدام الملقط الدقيق، افصل القوقعة عن العظم الصدغي وانقلها إلى طبق بتري يحتوي على محلول تشريح الأنسجة.

قم بتشريح كل كبسولة الأذن القوقعية بعناية ، مع ترك الأنسجة الرخوة الداخلية للقوقعة فقط. أمسك قطعة القوقعة بالملقط وقناة القوقعة بزوج آخر من الملقط ، ثم افصل الأنسجة ببطء. قم بإزالة السطور الوعائية والغشاء الصدري عن طريق تقشيرها برفق.

ضع غطاء بلاستيكيا معقما في محلول تشريح الأنسجة الجديد ، ثم ضع عضو كورتي على الغطاء مع التأكد من أن الغشاء القاعدي متجها لأسفل. قم بتثبيت الأنسجة عن طريق الضغط على غشاء Reissner والأنسجة المتبقية modiolus على الغطاء باستخدام الملقط. انقل الغطاء مع الأنسجة المضمنة إلى وسط طبق متحد البؤر 35 ملم.

ضع أسطوانة الاستنساخ الزجاجية على الطبق مع وضع نبتة القوقعة الصناعية في وسط الطبق وأضف 100 ميكرولتر من وسط زراعة النثرة إلى الأسطوانة. ضع 5,000 من الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع العظم أو الخلايا الجذعية الوسيطة في ملليلترين من وسط الاستزراع خارج الأسطوانة الزجاجية وضع الطبق في الحاضنة. بعد زراعة الخلايا كما هو موضح في المخطوطة النصية ، استنشق كل الوسائط داخل وخارج الأسطوانة وقم بإزالة الأسطوانة الزجاجية من الطبق متحد البؤر.

أضف ملليلترين من وسط الثقافة الطازجة إلى الطبق. ضعه في حاضنة رطبة حتى يصبح جاهزا للتحليل. استخدم نظام الفحص المجهري متحد البؤر مع حاضنة علوية للمرحلة.

قم بتشغيل المجهر متحد البؤر وضوء الفلورسنت والكمبيوتر. اضبط ظروف الحاضنة العلوية على 37 درجة مئوية و 5٪ جو ثاني أكسيد الكربون. ضع طبق العينة على وعاء تثبيت الأطباق ، وقم بتغطيته بغطاء تثبيت الطبق وأغلق الغرفة بغطاء السخان العلوي.

اضبط التكبير/التصغير والتركيز لتوطين جهاز Corti و MSCs في مجال الرؤية. افتح برنامج معالجة الصور. ضمن خيار تحديد الموقع، حدد هدف 20X أو فتحة رقمية 0.8 ومنطقة اقتصاص 0.5X.

ضمن الاستحواذ ، انقر فوق الإعداد الذكي وحدد EGFP. افتح علامة تبويب القناة تحت الاستحواذ واضبط طاقة الليزر على 0.2٪ ، والثقب على 44 ميكرومتر ، والكسب الرئيسي إلى 750 فولت ، والكسب الرقمي على 1.0. انقر فوق ESID ضمن إعداد التصوير واضبط كسب ESID على أربعة والكسب الرقمي على 7.5.

انقر على البلاط وقم بالحصة لإنتاج 210 بلاط. افتح استراتيجية التركيز وحدد وضع التركيز. ضمن السلاسل الزمنية، اضبط المدة على 24 ساعة والفاصل الزمني إلى 10 دقائق.

عند الاستحواذ ، اضبط حجم الإطار على 512 × 512 بكسل ، وسرعة المسح الضوئي إلى ثمانية ، والاتجاه إلى ثنائي الاتجاه ، والمتوسط إلى 4X ، والبتات لكل بكسل إلى 16. انقر فوق بدء التجربة لبدء التجربة. تم تتبع المسار ثنائي الأبعاد للخلايا الجذعية الوسيطة أو الخلايا الجذعية الوسيطة بطريقة التئام الجروح باستخدام أسطوانة زجاجية كحاجز بين الخلايا الجذعية الوسيطة وعضو كورتي.

عندما تم زراعة عضو كورتي ، نمت الخلايا الليفية بسرعة كبيرة إلى الخارج من خلايا الشعر الخارجية في الطبقة الخارجية. تم دفع معظم الخلايا الجذعية الجذعية المسماة ب GFP بواسطة الخلايا الليفية سريعة النمو. ومع ذلك ، اخترق البعض طبقة الخلايا الليفية وهاجروا بنجاح إلى عضو كورتي.

أظهرت نتائج 72 ساعة من الحضانة أن الخلايا الجذعية الجذعية هاجرت إلى عضو كورتي وكانت موضعية بشكل أساسي في modiolus والمنطقة التي تم فصل الألياف العصبية القوقعية عنها عن modiolus. تم تغيير مورفولوجيا الخلايا الجذعية الجذعية إلى شكل شعاعي مشابه لشكل الألياف العصبية. تم تحويل الخلايا إلى شكل خطي على طول خط الأطراف ، بدلا من منطقة الخلية الشعرية.

تمكنت الخلايا الجذعية الجذعية من الهجرة والنمو في منطقة تجمع الألياف العصبية عن طريق اختراق طبقات الخلايا المختلفة والحواجز المادية. عندما تم إحداث تلف لخلايا الشعر من خلال علاج لمدة 16 ساعة بالكاناميسين وتم زراعة الخلايا لمدة 72 ساعة أخرى بعد إزالة الكاناميسين ، تم توطين الخلايا الجذعية الجذعية ليس فقط في modiolus ، ولكن أيضا في خلايا الشعر الخارجية. يعد تثبيت الأنسجة خطوة مهمة في هذا البروتوكول حيث تم إرفاق عضو كورتي.

لا تسقط بسهولة. هذه نصيحة تافهة ولكنها مفيدة لثقافة الزرع الناجحة. يمكن تكييف هذه الطريقة لدراسة فعالية الإكسوسومات التي تفرز من الخلايا الجذعية الجذعية الجذعية