إعداد عينة النبات لقياس محتوى النيوكليوسيد/النيوكليوتيدات باستخدام جهاز HPLC-MS/MS

النيوكليوسيدات والنيوكليوتيدات هي المكونات الأيضية المركزية في جميع الكائنات الحية. عملية التمثيل الغذائي لهم مطلوب لتطوير الخلايا. يوفر هذا النهج أداة قوية لهذه الأيض 'كمي.

تسمح هذه الطريقة بالتحديد الكمي السريع والدقيق للنيوكليوسيدات والنيوكليوتيدات في النباتات. تستغرق عمليات المعالجة المسبقة الكاملة للعينات وتحليلات LC-MS/MS حوالي يومين لمجموعة من 10 إلى 20 عينة. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على جميع النباتات وحتى الكائنات الحية الأخرى.

وسوف يظهر هذا الاجراء تشانغهوا تشو الاستاذ المشارك من مختبر تشن . لزراعة النباتات، تأكد من أن بذور أرابيدوسي يتم تعقيمها في الإيثانول 70٪ لمدة 10 دقائق وزرعها على لوحات أجار مع 1/2 قوة موراشيج والمواد المغذية سكوغ. احتضان لوحات في الظلام في أربع درجات مئوية لمدة 48 ساعة، ثم نقلها إلى غرفة النمو التي تسيطر عليها تحت 16 ساعة من الضوء في 22 درجة مئوية وثماني ساعات من الظلام في 20 درجة مئوية.

حصاد 100 ملليغرام من الشتلات لمدة أسبوعين وتجميدها في النيتروجين السائل لاستخراج المستقلب. طحن 100 ملليغرام من الأنسجة النباتية المجمدة مع سبعة إلى ثمانية حبات الصلب في مطحنة خلاط المبردة مسبقا لمدة خمس دقائق على تردد 60 هيرتز. إعداد محلول الاستخراج، الذي يحتوي على الميثانول، أستونيتريل، والماء بنسبة اثنين إلى اثنين إلى واحد.

إعادة إنفاق المواد المتجانسة مع ملليلتر واحد من محلول الاستخراج. الطرد المركزي الحل الناتج في 12,000 XG لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية, ثم نقل 0.5 ملليلتر من تعليق إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر وتجميده في النيتروجين السائل. تتبخر العينة المجمدة في مجفف تجميد وإعادة إنفاقه في 0.5 ملليلتر من 5٪ أسيتونيتريل و 95٪ماء.

الطرد المركزي الحل الناتج في 4، 000 XG لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. تحميل supernatant في قارورة لقياس LC-MS / MS. إعداد خلات الأمونيوم 10 ملليمولار العازلة عن طريق حل 1.5 غرام من خلات الأمونيوم في لترين من الماء المزدوج deionized.

ضبط درجة الحموضة إلى 9.5 مع 10٪ من حمض الأمونيوم وخلات. إعداد لترين من الميثانول فائقة 100٪ لقياس النيوكليوسيدات، ثم إعداد لترين من أستونيتريل فائقة البوري لقياس النيوكليوتيدات. حقن 0.02 ملليلتر من استخراج المستقلب المعالجة مسبقا من كل عينة أعدت سابقا في نظام HPLC مع مضخات ثنائية مقرونة مطياف الكتلة رباعية ثلاثية.

لتوليد منحنيات المعايرة القياسية، تجمع ستة استخراج عينة معا ودوامة الخليط، ثم aliquot إلى ستة استخراج مرة أخرى للحصول على كل خلفية. إضافة ستة تركيزات مختلفة من كل معيار لهذه الاستخراجات الستة على التوالي وحقنها واحدا تلو الآخر في نظام HPLC. سجل مناطق الذروة لكل معيار بتركيزات مختلفة عبر التحولات الجماعية.

وقد استخدم هذا البروتوكول لتحديد وتحديد كميا N1-ميثيلادينوسين، وهو نواة معدلة معروفة، في شتلات من نوع أرابيدوسيس عمرها أسبوعان. وأشار ملف قياس الطيف الكتلي إلى أن أيونات المنتجات المتولدة من معيار N1-methyladenosine هي في نسب 150 و 133 MZ. ولوحظ نفس الملف في استخراج صفر كولومبيا.

ونظرا لارتفاع وفرة أيون المنتج من 150 MZ، تم اختيار الانتقال الشامل من 282.1 إلى 150 لتحديد N1-ميثيلادنوسين. وكان وقت الاحتفاظ بالذروة المستهدفة 7.05 دقيقة. نفس وقت الاحتفاظ بمعيار N1-ميثيلادينوسين.

وأضيفت سلسلة تركيز من معايير N1-methyladenosine إلى ستة استخراج عينة. وقد حقنت العينات المعيارية في ال LC-MS/MS، ورسمت مناطق الذروة المتزايدة من N1-methyladenosine مقابل التركيزات الاسمية للمعايير. تعتبر عمليات استخراج الخلفية الستة المتساوية مهمة لصنع منحنى معايرة دقيق وقابل للتكرار للقياس الكمي.

يمكن تطبيق طريقتنا لاستكشاف مسارات التمثيل الغذائي في النباتات. من خلال مقارنة ملامح المستقلب بين البرية من نوع وفقدان وظيفة المسوخ، يمكن رسمها تدفق الأيض.