التبلور والتصميم الهيكلي للانزيم: مجمع الركيزة بواسطة البلورات التسلسلية في رقاقة Microfluidic متعددة الاستخدامات
مارس 20, 2021
يوصف جهاز microfluidic متعدد الاستخدامات الذي يمكّن من تبلور إنزيم باستخدام طريقة الانتشار المضاد ، وإدخال الركيزة في البلورات عن طريق النقع ، وتحديد الهيكل ثلاثي الأبعاد للأنزيم: مجمع الركيزة من خلال تحليل متسلسل للبلورات داخل الشريحة في درجة حرارة الغرفة.
مرحبا، ومرحبا بكم في الهندسة المعمارية المختبرية والتفاعل من RNA في معهد البيولوجيا الجزيئية وخلية في ستراسبورغ. إن زراعة بلورات جيدة التغوط هي خطوة حاسمة في أي دراسة بلورية. في هذا الفيديو، سوف نبرهن على استخدام أداة جديدة microfluidic لزراعة بلورات من الجزيئات الحيوية وتحديد هيكلها ثلاثي الأبعاد عن طريق الحيود في الموقع بالأشعة السينية.
الجهاز microfluidic يسمى ChipX يقدم العديد من المزايا. وهي مصممة لتصغير وتسهيل أصول التبلور من خلال طريقة الانتشار المضاد. إعدادها سهل ويتم تنفيذه مع مواد معملية قياسية.
كما أنها الأمثل للتوصيف المباشر للبلورات التي تزرع في رقاقة عن طريق التصوير البلوري بالأشعة السينية المسلسل. تشيب إكس يزيل مناولة البلورات والخطوات التبريد يحافظ على نوعية جوهرية من البلورات التي يتم تحليلها في الموقع وفي درجة حرارة الغرفة. ChipX لديه شكل شريحة المجهر، 7.5 في 2.5 سم.
وهو يحتوي على ثماني قنوات microfluidic تستخدم كغرفة تبلور مع قسم من 80 في 18 ميكرومتر وطولها أربعة سنتيمترات. يسمح المدخل على الجانب الأيسر للحقن اليدوي للمحلول الجزيئات الحيوية الذي سيملأ القنوات الثماني حتى الخزانات. يتم إيداع حلول التبلور في هذه الخزانات على الجانب الأيمن.
يتم تشغيل التبلور من قبل ظاهرة تسمى الانتشار المضاد. عندما ينتشر عامل التبلور في محلول الجزيئات الحيوية ويخلق تركيزًا وتدرجًا فائقًا للتشبع. التسميات وbost على طول القنوات تساعد على تحديد موقع بلورات أكثر سهولة.
يتطلب إعداد شريحة خمسة إلى ستة ميكرولترات من محلول الجزيئات الحيوية بتركيز نموذجي من خمسة إلى 10 ملليغرام لكل ملليلتر. واحد زيت البارافين microlitre، خمسة ميكرولترات من محلول التبلور لكل خزان وشريط لاصق. يتم تنفيذ تحميل ChipX يدويا مع micropipette والنصائح القياسية.
يتم استخدام حل عينة زرقاء في هذا المثال للحصول على تصور أفضل لعملية الحقن. لتجنب التسرب، يتم إدخال طرف في مدخل العينة عموديا على رقاقة. يتم تحميل ميكرولتر واحد من زيت البارافين بعد العينة لفصل القنوات عن بعضها البعض.
ثم يتم إغلاق مدخل العينة مع الشريط. يتم تحميل الخزانات الثمانية بشكل فردي مع خمسة ميكرولترات من محلول عامل التبلور. للقيام بذلك، يتم وضع طرف ماصة قريبة من نهاية القناة بزاوية حوالي 45 درجة.
وهذا يمنع تشكيل فقاعة الهواء بين العينة وعامل تبلور. ويمكن ملء الخزانات بالكوكتيلات التي تحتوي على مختلف المخازن المؤقتة أو البوليمرات أو الأملاح، وما إلى ذلك، للفحص أو التحسين. خزانات مغلقة مع الشريط.
كما هو موضح هنا ، يعد إعداد شريحة سهلة ويستغرق بضع دقائق فقط. في ChipX ، يحدث التبلور عن طريق الانتشار المضاد. عوامل تبلور المودعة في الخزانات تنتشر في القنوات التي تحتوي على الجزيئات الحيوية.
وهذا يخلق تدرجات من التركيز والتشبع الفائق الذي سيؤدي إلى التبلور. هذه هي أمثلة من بلورات انزيم تم الحصول عليها داخل القنوات. قد تنمو لملء القنوات التي لديها مقطع عرضي من 80 في 80 ميكرومتر.
بلورات يمكن اكتشافها بسهولة في ChipX عن طريق المجهر الفلوريسنس باستخدام الفلوريسنس الطبيعي من بقايا التربتوفان تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية، أو كما هو مبين هنا باستخدام بروتين المسمى الفلورسنت. يُظهر هذا القسم تحليلًا تلغرافيًا من Chris تم إجراؤه في مصدر الضوء السويسري في filaggrins سويسرا. ويمكن حمل رقائق إلى السنكروترون دون أي معدات إضافية أو رعاية خاصة.
دعونا ندخل قاعة مصدر الضوء السويسري. الإلكترونات تدور في الحلقة المركزية وتوليد طيف واسع من الموجات الكهرومغناطيسية، بما في ذلك الأشعة السينية المستغلة في خطوط شعاع مختلفة. تم تسجيل هذا الفيديو في X06 ، وهو خط شعاع مخصص لعلم البلورات الجزيئية الكلية.
قد يتغير البروتوكول من مرفق واحد السنكروترون إلى الآخر، ولكن المبدأ العام لا يزال هو نفسه. تم تركيب ChipX على حامل مطبوع ثلاثي الأبعاد. ثم يتم إرفاق هذا الحامل إلى المغناطيس من goniometer القياسية.
التحليل التسلسلي ثابت جمع البيانات من سلسلة من البلورات نمت في رقاقة. يتم إنشاء قوائم من المواقف الكريستال باستخدام التسميات وbost على طول قنوات رقاقة. يقوم الباحثون بنقل الشريحة لمركز البلورات في شعاع الأشعة السينية الذي يرمز إليه الإطار الأصفر.
يتم إطلاق إجراء توسيط سريع باستخدام شعاع الأشعة السينية. تتوقف الشعاع ترتفع في مكانها ويتحرك الكاشف نحو العينة. يتم إجراء فحص الشبكة لضمان محاذاة البلورة مع الحزمة.
يتم تكرار نفس الإجراء بعد تدوير الشريحة بمقدار 30 درجة. الخطوة الثانية مهمة لأن المادة رقاقة يخلق تأثير المنظر الذي يؤدي إلى تحول الحد الأقصى للانعراج فيما يتعلق موقف الكريستال لوحظ. بمجرد أن يتم تمركز البلورة في الحزمة يبدأ جمع البيانات.
هذا التسلسل يظهر جمع البيانات في الوقت الحقيقي. رقاقة تدور بمقدار 30 درجة. وفي الوقت نفسه، يتم جمع صور الحيود المقابلة بواسطة الكاشف.
وصف هذه الكريستالة كامل. رقاقة ترجمت إلى البلورة المقبل في القناة ويتم تكرار الإجراء كله. لاحظ أن هذا التحليل يتم تشغيله في الموقع دون التعامل المباشر مع الكريستال وفي درجة حرارة الغرفة.
ثم يتم دمج البيانات التي يتم جمعها على سلسلة من البلورات للحصول على مجموعة بيانات كاملة عن الحيود تستخدم لحساب خريطة كثافة الإلكترون، تظهر باللون الأزرق، ولبناء النموذج الذري. تم تطبيق الإجراء الموصوف في هذا الفيديو في إطار التوصيف الهيكلي لميناء إنزيم التعديل الـ TRNA. إنزيم CCA-إضافة من البكتيريا الباردة تكييفها، Planococcus halocryophilus.
تم استخدام ChipX لبلورة الإنزيم عن طريق الانتشار المضاد في وجود كبريتيد الأمونيوم كعامل تبلور. ظهرت بلورات جانبية هرمية على طول القنوات ، بعد بضعة أيام من الحضانة عند 20 درجة مئوية. سهل وضع العلامات الفلورية للبروتين تحديد بلورات البروتين وتمييزها من بلورات الملح.
تم تحليل سلسلة من البلورات في الموقع وفي درجة حرارة الغرفة. تم دمج بيانات الحيود الخاصة بهم وأدت إلى الهيكل البلوري لمنزيم APOE بدقة 2.5 angstrom. وبالإضافة إلى ذلك، تم استغلال انتشار البيئة في قنوات رقاقة لتقديم الركيزة إلى الانزيم الذي يبني بلورات.
وفي هذه الحالة، أضيف تناظري من CTP إلى حلول الخزان قبل يومين من تحليل السنكروترون. هذا سمح للمجمع أن ينتشر والوصول إلى موقع الحفاز للأنزيم. كما رأينا في بنية الكريستال من مجمع يحدد في قرار من 2.3 angstrom.
البروتوكول الذي يظهر في هذا الفيديو هو قابل للتطبيق عموما وقد تم اختباره على مجموعة متنوعة من الجزيئات الحيوية. في الختام ChipX هي أداة رقاقة مختبر التي تدمج جميع الخطوات من دراسة بلوريغرافية ويسمح لك للانتقال من الحل الطبية الحيوية إلى بنية الكريستال في جهاز microfluidic فريدة من نوعها. شكراً لمشاهدة هذا الفيديو.
ونأمل أن نكون قد أقنعك بفوائد استخدام ChipX لبلورة وتحديد بنية الكريستال من المفضلة لديك من قبل Biomolecule.
نظرة عامة
تصف هذه المقالة جهازًا مجهريًّا مائيًا، ChipX، مصممًا لبلورة الإنزيمات باستخدام الانتشار المعاكس. إنه يسهل نمو بلورات عالية الجودة ويسمح بتحليل حيود الأشعة السينية في الموقع.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- المجهريات المائية
- بلورة
- علم الأحياء البنيوي
الخلفية
- البلورية ضرورية لتحديد التركيب الثلاثي الأبعاد للجزيئات الحيوية.
- تتضمن الطرق التقليدية خطوات معقدة للتعامل والتبريد بالبرودة.
- يمكن للأجهزة المجهرية المائية تبسيط عملية البلورة.
- ChipX محسّن لتمييز البلورات مباشرةً في درجة حرارة الغرفة.
هدف الدراسة
- لإظهار استخدام ChipX لبلورة الإنزيمات.
- لعرض مزايا حيود الأشعة السينية في الموقع.
- لتوفير بروتوكول لاستخدام الجهاز بشكل فعال.
الطرق المستخدمة
- إعداد ChipX مع الجزيئات الحيوية وحلول البلورة.
- البلورية عبر الانتشار المعاكس في القنوات المجهرية المائية.
- حيود الأشعة السينية في الموقع للتحليل البنيوي.
- جمع البيانات من بلورات متعددة دون التعامل.
النتائج الرئيسية
- النمو الناجح لبلورات الإنزيمات باستخدام ChipX.
- قدم التحليل في الموقع بيانات حيود عالية الجودة.
- أدى التخلص من التعامل مع البلورات إلى تحسين سلامة البلورة.
- تم إثبات التطبيق على إنزيم إضافة CCA من Planococcus halocryophilus.
الاستنتاجات
- ChipX هو أداة متعددة الاستخدامات لبلورة الجزيئات الحيوية.
- يبسِّط العملية ويعزز جودة البيانات.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة على العديد من الجزيئات الحيوية للدراسات البنيوية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
High-quality structural determination of enzyme:substrate complexes is a critical inflection point in early drug discovery and target validation. The ChipX microfluidic platform enables in situ crystallization and serial X-ray analysis, reducing sample handling and preserving crystal integrity for more reliable structural insights. This integrated workflow supports predictive confidence in structure-based drug design and accelerates portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of enzyme:substrate interactions for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by providing high-resolution structural data.
- Facilitates rapid hypothesis testing through streamlined crystallization and analysis.
Screening & Assay Development
- Delivers reproducible, convection-free crystal growth for assay standardization.
- Allows parallel screening of crystallization conditions within a single chip.
- Provides quantitative diffraction outputs for reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Preserves native-like crystal environments for disease-relevant structural studies.
- Enables substrate diffusion into crystals, supporting translational biomarker alignment.
- Maintains continuity from discovery-stage structural biology to preclinical validation.
Pipeline & Workflow Integration
ChipX integrates seamlessly from early discovery through lead identification by enabling in situ structural analysis without cryo-cooling or manual crystal handling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven target interrogation and pathway clarification via direct structure determination.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible crystals for downstream screening workflows.
- Analytics: Generates high-quality diffraction datasets for robust comparative analysis.
- Translational Research: Facilitates substrate soaking and complex formation for translationally relevant targets.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable platform adaptable to diverse biomolecules and targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Minimizes manual handling, enhances reproducibility, and streamlines workflows.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and improves capital efficiency by reducing late-stage risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics and crystallography for optimal setup and analysis.
- Needs access to synchrotron or advanced X-ray diffraction infrastructure.
- Demands cross-team standardization for chip loading and data collection protocols.
- Adaptable to a range of protein and enzyme systems with minimal protocol modification.
- Limited by the size and type of biomolecules compatible with microfluidic channels.
