التسجيل الكهربائي لمناطق القشرة الدماغية التي تم التلاعب بها باستخدام فيروس مرتبط بال أدينو يستهدف كوفلين في الفئران

يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد دور أهداف جزيئية فردية محددة في تنظيم النشاط الكهربائي خلال حالات فيجيلين المختلفة. من بين فوائد استخدام الفيروس المرتبط بال أدينو هو القدرة على استهداف منطقة معينة في الدماغ ونوع معين من الخلايا على وجه التحديد. إثبات البروتوكول سيكون جوليان دوفورت جيرفيه، باحث مشارك من فريقي.

بعد التأكد من عدم وجود استجابة لرد الفعل قرصة إصبع القدم في مخدر الماوس 12 أسبوعا من العمر، واستخدام أداة تشذيب الشعر لحلاقة الشعر من الجزء الخلفي من الأذنين إلى الجزء الأمامي من الرأس بين العينين. إضافة قطرة سخية من مرهم العيون إلى كل عين لمنع الجفاف واستخدام قضبان الأذن لإصلاح بعناية رأس الماوس على جهاز ستيريوتاكسيك. سحب اللسان بلطف من الفم لتجنب الاختناق.

إصلاح أنف الفأرة للجهاز واستخدام 70٪ الإيثانول لتعقيم الجلد المكشوفة على الرأس. عقد الجلد مع ملقط Graefe غرامة اضافية، واستخدام مقص الأنسجة لقطع الجلد من قاعدة الأذنين إلى مستوى العينين ووضع اثنين من المشابك الجراحية على كل جانب من شق لتمتد الجلد وتعريض الجمجمة. تجنب خياطة الدماغ، استخدم طرف مقص لخدش سطح الجمجمة لإزالة الغشاء المحيطي وخلق خطوط متداخلة في اتجاهين أو أكثر.

استخدام الإيثانول 70٪ لإزالة شظايا العظام وتطهير الجمجمة. مع قنية أعدت سابقا ثابتة على الذراع ستيريوتاكسيك، وتحديد موقع bregma ولامدا ونلاحظ إحداثيات ستيريوتاكسيك من كل. استخدام الذراع ستيريوتاكسيك وقلم لوضع علامة على موقف القنية على الجمجمة 1.5 ملليمتر الحق الجانبي إلى خط الوسط و 1.5 ملليمتر الأمامي إلى bregma.

باستخدام بت حفر 0.7 ملليمتر، اخترق بعناية الجمجمة في موقف ملحوظ عمودي على سطح الجمجمة ومحاذاة مع المحور الرأسي وغسل الجمجمة مع طرف القطن العقيم غارقة في محلول اليود بيتادين بوفيدوني 10٪، ثم التراجع عن المكبس من حقنة 10 ميكرولتر بواسطة ميكرولتر واحد لتحميل قنية مع فقاعة الهواء ميكروليتر واحد. بعد ذلك، اخلطي خليط AAV من الاهتمام مع الأنابيب البطيئة وأضف 1.7 ميكرولتر من الخليط إلى طبق بيتري معقم. استخدم هذه الحقنة لتحميل 1.5 ميكرولتر من المحلول في القنية ووضع علامة على موضع فقاعة الهواء على أنبوب PE50 المتصل.

عموديا محاذاة القنية مع ثقب في الجمجمة بحيث تصل القنية إلى الحافة العليا من العظام ووضع علامة على تنسيق Z من سطح الجمجمة. خفض ببطء قنية حتى الطرف يصل إلى 1.5 ملليمتر تحت سطح الجمجمة وطبقة خمسة من قشرة المحرك وبدء مضخة حقنة بمعدل تدفق 0.025 ميكرولتر في الدقيقة الواحدة لتقديم ميكرولتر واحد من AAV على مدى 40 دقيقة. استخدام فقاعة الهواء في أنبوب لتتبع الحقن، وإجراء أي تعديلات حسب الضرورة.

عندما يتم تسليم الحجم الكامل للفيروس، اترك القنية في مكانها لمدة خمس دقائق لضمان انتشار كاف وتجنب التدفق الخلفي قبل رفع الذراع المجسمة ببطء وبعناية لإزالة القنية من القشرة. لزرع القطب الكهربائي، استخدم ملقط كيلي المستقيم لشد قطب كهربائي واحد ببطء بسلك ذهبي مستقيم في المحور الرأسي للثقب الذي تم حقن AAV فيه، تاركا ما لا يقل عن 2.5 ملليمتر من المسمار خارج الجمجمة لتقليل الضرر الذي لحق بالدورا والقشرة الدماغية. استخدام قلم لوضع علامة على موقف القطب المرجعي 2.6 ملليمتر الحق الجانبي إلى خط الوسط و0.7 ملليمتر الخلفي إلى bregma وموقف القطب الكهربائي الخلفي في 1.5 ملليمتر الجانب الأيمن إلى خط الوسط و 1.5 ملليمتر الأمامي إلى لامبدا ومواقف ثلاثة مسامير الصيانة على نصف الكرة الأيسر مع عدم وجود إحداثيات محددة، ولكن بعيدة قدر الإمكان عن بعضها البعض ومن الأقطاب الكهربائية.

استخدام الحفر لثقب بعناية الجمجمة عمودي على سطح الجمجمة في المواقف ملحوظ من الأقطاب الكهربائية الأخرى ومسامير وغسل الجمجمة مثقوبة مع محلول اليود 10٪povidone. كتلة الثقوب مع قطع صغيرة تدحرجت من مسح مهمة حساسة قبل تثبيت مسامير لمنع النزيف والتلوث واستخدام ملقط كيلي على التوالي لإدراج مسامير في ثقوب الحفر في نفس الزاوية التي تم ثقب الثقوب. ضع بضع قطرات صغيرة من أسمنت الأسنان في وسط الفضاء الشبيه بالحلقة داخل البراغي واستخدم ملقط Graefe فائق الغرامة لرفع الجلد فوق عضلات الرقبة.

باستخدام Dumont رقم خمسة ملقط، عقد الطرف المنحني من قطب كهربائي واحد وإدراجه ما يقرب من 1-2 ملليمتر في العضلات. ضع الجانب المنحني ونقطة الطي للقطب الكهربائي في أسمنت الأسنان وأدخل القطب الكهربائي الثاني بنفس الطريقة. بعد تغطية عيون الحيوان، وتطبيق الضوء لمدة ثلاث إلى خمس دقائق لترسيخ الاسمنت واستخدام أسمنت الأسنان إضافية لتغطية قاعدة الأقطاب الكهربائية ومسامير مرساة لتشكيل كفاف على شكل تاج.

بعد تطبيق ثلاث إلى خمس دقائق أخرى من الضوء، وملء مركز المونتاج مع الاسمنت الاكريليك وإزالة المشابك الجراحية. استخدم خياطة أحادية الفلترة قابلة للامتصاص الاصطناعية لإغلاق الجلد في الجزء الأمامي والخلف من المونتاج بحيث لا تتعرض الجمجمة واستخدام ملقط منحني لتثبيت الموصل فوق المونتاج لمحاذاة الأسلاك الذهبية للأقطاب الكهربائية بعناية مع دبابيس الموصل ، ثم سرعان ما يلحام كل طرف قطب كهربائي إلى دبوس موصل واحد مقابل. بعد إزالة الماوس من الإطار، قم بتغطية المساحة الفارغة بين الموصل والرأس باستخدام الاسمنت الأكريليك.

وبعد وزنها، ضع الماوس في قفص نظيف مع غطاء غير متشابك على لوحة الحرارة. بعد أسبوعين من الجراحة، قم بتوصيل الفئران بتسجيل الكابلات وبعد أسبوع واحد على الأقل، سجل الإشارات الكهربائية والكهروميوغرافية لمدة 24 ساعة أو أكثر. يتم تأكيد العدوى الناجحة عن طريق تلطيخ HA للخلايا العصبية داخل القشرة الحركية المحيطة بموقع الحقن ، مما يشير إلى وجود cofilin S3D HA. تلطيخ مشترك مع علامة الخلايا العصبية مثير CaMKII ألفا يشير واضحة cofilin S3D HA وCaMKII ألفا التعبير المشترك تحت التكبير عالية.

سجل تحول أطياف الطاقة النسبية لليقظة، والنوم موجة بطيئة، والنوم متناقضة تظهر الاختلافات الخاصة بالدولة في النشاط الطيفي تحت تعطيل كوفلين. وينطبق الجمع بين التسجيل الكهربائي والتلاعب بوساطة AAV للأهداف الجزيئية الدقيقة أيضا على مناطق الدماغ المتعددة وعلى مجالات فرعية أخرى في علم الأعصاب مثل البحث في الصرع أو الذاكرة بالإضافة إلى النوم.