إعداد شرائح حادة من الحصين دورسال لتسجيل الخلية الكاملة وإعادة بناء الخلايا العصبية في Gyrus Dentate من الفئران الكبار

الهدف العام لهذا الإجراء هو إعداد شرائح حادة صحية من منطقة متوسطة الظهرية من قرن آمون للتسجيلات طويلة الأجل وإعادة بناء الخلايا العصبية في الفئران الكبار. العديد من المختبرات مثل لنا، ودراسة الحصين الظهري لدورها في التعلم الخاصة والملاحة. التقنيات الشائعة المستخدمة لهذا الغرض هي التجارب السلوكية، والتعقب التشريحي، والتلاعبات الإقليمية المحددة.

لقد طورنا طريقة تشريح الدماغ للجمع بين الفيزيولوجيا الكهربائية مع هذه التقنيات للسماح للارتباط المباشر من invivodata داخل تسجيلات الفيديو. وميزة هذا البروتوكول هو أنه يجمع بين إجراء بسيط للحصول على شرائح عرضية مع استخدام محلول حماية لتعزيز صلاحية أنسجة الدماغ. هذا النهج مناسب بشكل خاص عندما يتم استخدام الحيوانات الناضجة كما هو الحال في التجارب السلوكية.

لبدء هذا الإجراء، إعداد بجوار بالوعة المعدات اللازمة لهذا القسم. إعداد على الجليد منقار 150 ملليلتر واثنين من الأطباق بيتري الزجاج قطر كل 10 سنتيمترا. رسم ثلاثة أجزاء من خطوط حتى الجزء السفلي من طبق بيتري البلاستيكية ووضع هذا الطبق على مقربة من صينية الجليد.

سوف تحتاج أيضا الغراء وحامل العينة لهزومي. ثم تجهيز مقاعد البدلاء عملية جراحية مع مقص كبير، مقص صغير، مدورة تلميح ملاقط، والملاقط تلميح غرامة، ملعقة معدنية رقيقة، ملعقة معدنية كبيرة، والماصات نقل. قشر أطباق بيتري مع حل القطع.

طبق واحد لإجراء تشريح الرأس والآخر لتشريح الدماغ. في هذا الأخير، أيضا وضع قطعة من ورقة مرشح. أيضا ملء beaker مع 30 مللي حل القطع.

وسوف تكون هناك حاجة لهذا ل perfusial. ملء علبة هزاز مع الجليد الباردة حل القطع والحفاظ على جميع حل أكسجين مع جهاز carbogen محتدما. إضافة الثلج المسحوق المصنوع من دفعة المجمدة من حل قطع إلى الباردة الطازجة قطع في حل للحفاظ على درجة الحرارة إلى أسفل.

انتبه، للحفاظ على الجليد من النصل أثناء تقطيع. يتم تنفيذ جميع الخطوات تقريبا بعد كابيتيشن ضمن الحلول. وهذا يساعد على الحفاظ على الحرمان من الأكسجين الأيضي إلى أدنى حد ممكن.

إعداد غرفة حضانة مليئة بمحلول القطع تحت الأكسجين المستمر. ضع الغرفة في حمام مائي مُدفأ قبل ذلك عند درجة حرارة 35 درجة مئوية. إعداد غرفة تخزين شريحة مع العديد من الآبار المستقلة وملء مع حل التخزين.

يبقيه تحت الأوكسجين المستمر في درجة حرارة الغرفة. في حالة أنّ النسيج عبّر عن بروتين فلورسنت أو ضوء تنشيط opsonin. فمن المستحسن للحفاظ على الغرفة في الظلام.

على سبيل المثال، داخل المربع. بعد أداء الذجّر عبر القلب، ضع رأس الفأر في طبق بيتري مع محلول القطع البارد. افتح الجلد بمقص ناعم لفضح الجمجمة.

بدءا من ماغنوم الحصيفة، وقطع على طول خياطة القوس حتى الوصول إلى خياطة الأنف والصفة. كن حذراً لسحب قليلاً حتى مقص لتجنب تلف الدماغ. قم بعمل شقين في قاعدة الجمجمة.

استخدام ملاقط تلميح مقربة لسحب ما يصل العظام الجدارية. كن حذراً لإزالة السحايات أيضا. إذا تركت فإنها يمكن أن تلحق الضرر الدماغ أثناء الاستخراج.

استخدم الملعقة الصغيرة لتخفيف الدماغ بلطف من قاعدة الجمجمة. مع ملعقة صغيرة، افصل الدماغ عن الأعصاب القحفية ونقل الدماغ على قطعة صغيرة من ورق التصفية في طبق بيتري الثاني. قطع الدماغ في النصفين على طول الشق الطولي باستخدام شفرة ما قبل المبردة.

فصل نصفي الكرة باستخدام أصغر ملعقة. استخدام أكبر ملعقة لنقل نصف الكرة الأرضية واحد إلى طبق بيتري البلاستيك مع سطحها الوسيطة التي تواجه أسفل. محاذاة القشرة الجدارية مع واحد من الخطوط المتوازية أن يكون مرجعا لقطع الثاني.

استخدام قطعة من ورقة مرشح لتجفيف حل الزائدة. ضع النصل بالتوازي مع الخطوط وقطع الجزء البطني من نصف الكرة الأرضية. سيتم لصق هذا السطح المُسطح لاحقًا على حامل العينة.

العودة نصف الكرة الأرضية في حل القطن المؤكسج من طبق بيتري الزجاج وتنفيذ نفس الإجراء في نصف الكرة الثاني. ضع قطرة من الغراء سيانوكريلات على حامل العينة هزاز ونشرها مع ملعقة لخلق طبقة رقيقة. نقل نصف الكرة إلى حامل هزاز مع الجانب البطني إلى أسفل باستخدام الجانب مدورة من ملعقة.

بدء هذا التقطيع من القشرة الجدارية من شأنه أن يقلل من الوقت اللازم لجمع المنطقة الظهرية من قرن آمون. إضافة بضع قطرات من حل قطع الباردة لترسيخ الغراء. حرك حامل العينة في صينية الاهتزاز ومع الإعدادات المناسبة، شريحة الدماغ حتى منطقة الحصين الظهري مرئية.

ثم، وجمع شرائح مع استخدام ماصة نقل البلاستيك. نقل كل شريحة في غرفة الحضانة والسماح لها بقية لمدة 12 دقيقة. في هذه الأثناء، المضي قدما في قطع الشرائح التالية.

بعد 12 دقيقة من الحضانة، قم بنقل الشرائح إلى غرفة التخزين. واتركه يرتاح حتى بداية التجربة لإثبات نقاء إعدادنا، قارنا ذلك بإعداد إكليالي والذي يستخدم عادة للتسجيل من الحصين الظهري.

هو مبين هنا، التداخل التفاضلي التباين ميكروجراف المكتسبة من شفرة العلوي من gyrus دنت في شرائح حادة من الفئران عمرها شهرين. في شريحة عرضية أظهرت الخلايا العصبية في الغالب الأسطح الملساء والحدود المتناقضة المرجحة فقط، التي تشير إليها الأسهم السوداء. الخلايا العصبية في شرائح كورونال ولكن في كثير من الأحيان ظهرت بالطبع وعرض الخطوط العريضة المتناقضة بقوة، المشار إليها من قبل السهام البيضاء.

وهذا يشير إلى تحسين صلاحية الخلايا العصبية في شريحة عرضية. وفقا لهذا الانطباع، كان متوسط الوقت لختم تشكيل أثناء التصحيح في شرائح عرضية لدينا بشكل ملحوظ أكثر سرعة مما كانت عليه في شرائح الإكليلية. باعتبارها وكيلا عاما لسلامة الخلية، ونحن نسجل أن غشاء بقية إمكانات الخلايا الحبيبية وparvalbumin الخلايا العصبية بين إيجابية التي حيث أكثر بكثير من إزالة القطب في كلا النوعين الخلية في شرائح الإكليلي مقابل عرضية.

الذي أدى في النهاية في خلايا أكثر بكثير التي كان لا بد من استبعادها في إعداد التاجية. كما المحاور خلية الحبيبية تشغيل في الطائرة عرضية، وإعادة بناء الخلايا المسجلة أدى إلى استرجاع ال arborization محور عصبي كاملة في إعدادنا. لم يكن هذا هو الحال في شرائح الإكلال حيث قد تكون المحاور قد قطعت بسهولة.

بالإضافة إلى ذلك ، سمح إعادة البناء المورفولوجية للخلايا العصبية البينية الإيجابية البارفالبوين في الشرائح العرضية بتصوير ال arborization واسعة النطاق وتشعب ، بما في ذلك تصور تفاصيل صغيرة ، مثل العمود الفقري التشعبي. على كل شيء، وقد قدمنا طرق تشريح للحصول على شرائح قرن آمون عرضية مع جدوى الخلايا العصبية العالية للفئران الكبار. يمكن استخدام هذه الطريقة لقياس الفيزياء الكهربائية في المختبر مع الدراسات التشريحية والسلوكية مع التركيز على الجزء الظهري الوسيط من قرن آمون.