استخدام Grafix للكشف عن المتفاعلات العابرة من Saccharomyces cerevisiae التشبيكليسومات الفرعية
نوفمبر 9, 2020
هنا، ونحن نصف استخدام Grafix (تثبيت التدرج)، والطرد المركزي التدرج الجلسرين في وجود crosslinker، لتحديد التفاعلات بين عوامل الربط التي تربط عابرا إلى مجمع اللصق.
تساعد طريقة تثبيت التدرج ، التي يتم فيها إجراء الطرد المركزي لتدرج الجلسرين في وجود رابط متقاطع ، على تحديد التفاعلات بين البروتينات التي ترتبط بشكل عابر بمجمعات متعددة الوحدات الفرعية. يؤدي استخدام كواشف التثبيت في تدرج الجلسرين إلى استقرار ارتباط العوامل السائبة ، دون تكوين الرواسب ، مما يسمح بتحديد تفاعلات بروتينات معينة مع شبه المركب المقصد. يساعد عرض البروتوكول النهائي المستخدمين لأول مرة على تعلم المعلومات التي قد يصعب فهمها من النص المكتوب وحده.
لتحضير مستخلص الخميرة الكلي ، قم بزراعة خلايا الخميرة التي تعبر عن أحد عوامل التضفير المدمجة في علامة الصنبور ولتر واحد من وسط الجلوكوز Y و B المكمل بالأحماض الأمينية المناسبة أو القواعد النووية. عندما تصل المزرعة إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر من واحد ، اجمع خلايا الخميرة عن طريق الطرد المركزي في ثلاث زجاجات طرد مركزي سعة 500 مل ، واغسل الخلايا مرتين في 10 مل من الماء البارد المعقم لكل غسلة. بعد الغسيل الثاني ، أعد تعليق الخلايا في واحد من 10 حجم الخلية من المخزن المؤقت البارد A ، وقم بتجميد 50 قطرة ميكرولتر من معلق خلية الخميرة في النيتروجين السائل.
بعد التجميد ، قم بطحن كريات الخلايا المجمدة من خلال ست دورات عند 20 هرتز لمدة ثلاث دقائق في جهاز مطحنة كروية ، وغمر حاوية الخلايا المجمدة في النيتروجين السائل في نهاية كل دورة. بعد الدورة الأخيرة ، ضع الأنابيب التي تحتوي على المستخلصات في الماء في درجة حرارة الغرفة مع الرج العرضي. بمجرد الذوبان ، جهاز الطرد المركزي لجمع المستخلصات.
وتحديد البروتين الذي تم تطهيره بواسطة طريقة BCA. ثم قم بتجميد كميات المستخلصات في النيتروجين السائل لتخزين 80 درجة مئوية تحت الصفر. لتحضير تدرج الجلسرين ، أضف تركيزا نهائيا بنسبة 0.1٪ من عامل الربط المتقاطع الجلوتارالديهايد إلى محلول 30٪ من الجلسرين والمخزن المؤقت A ، واخلطه للتجانس.
أضف ستة ملليلتر من الجلسرين البارد بنسبة 10٪ والمحلول العازلة A إلى أنبوب طرد مركزي سعة 12 ملليلتر واستخدم حقنة جهاز رئيسي متدرج مجهزة بإبرة طويلة لطبقة محلول الجلسرين 30٪ من الجلوتارالديهايد في الجزء السفلي من الأنبوب. استخدم جهازا رئيسيا للتدرج لإنشاء تدرج خطي للجلسرين وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. ضع طبقة بعناية 200 ميكرولتر من 7٪ من الجلسرين والمخزن المؤقت وسادة في الجزء العلوي من التدرج قبل إضافة ما يقرب من ملليغرامين من مستخلص الخلية إلى الجزء العلوي من الأنبوب.
بعد توليد تدرج الجلسرين ، ضع العينة في دوار دلو متأرجح مبرد مسبقا واجمع المستخلص عن طريق الطرد المركزي. اقتبس العينة من كل أنبوب عينة سعة 12 مليلتر في 24 500 جزء ميكرولتر ، واستخدم مضخة تمعجية لدفع محلول الجلسرين بنسبة 40٪ عبر التدرج بنسبة 10 إلى 30٪ من الأنبوب إلى مجموعة الكسور. ثم قم بتحميل 50 ميكرولترا من كل جزء مباشرة على أغشية النيتروسليلوز على لطخة نقطية ، متبوعا بإضافة المخزن المؤقت المانع ، واستخدم جسما مضادا أوليا ضد CBP للكشف عن البروتين الموجود على اللطخة المناعية ، وجسم مضاد ثانوي مناسب حسب الضرورة.
في حالة عدم وجود رابط متقاطع ، يتركز CWC 24 بين الكسرين خمسة و 13 ، المقابلة لمجمعات من حوالي 80 إلى 200 ميغا دالتون. ومع ذلك، في وجود الرابط المتقاطع يتحول موضع CWC 24 على التدرج إلى كسور في أسفل التدرج المقابل للمجمعات الأكبر. بمقارنة ترسيب CWC 24 بترسيب الوحدة الفرعية U5 snRNP ، Prp8 ، والوحدة الفرعية NTC ، يكشف Prp19 أن CWC 24 يتركز في نفس الكسور.
ولكن نظرا لأنه يرتبط بشكل عابر بالجسيم اللاصق ، فهو موجود أيضا في الكسور الأخف. ومن المثير للاهتمام أن الكسور 11 و 12 هي تلك التي يبدأ فيها Prp8 و 19 في التركيز ، مما يشير إلى أن هذا هو جزء التدرج حيث يبدأ مركب B Act في الترسيب. يكشف تحليل اللطخة الغربية للكسرين 11 و 12 عن إشارات Prp8 و 19 كمسحات بالكاد تدخل هلام أكريلاميد بنسبة 8٪ ، مما يدل على أنها بالفعل جزء من مجمعات كبيرة.
يوجدCWC 24 أيضا في الجزء 12 ، ولكن بتركيز أقل بكثير ، بما يتفق مع ارتباطه العابر بمركب B Act. مجتمعة ، تظهر هذه النتائج أنه يمكن استخدام الجلوتارالديهايد كرابط متقاطع لتحقيق الاستقرار في ارتباط العوامل العابرة بالمجمعات الفرعية للتضفير. يمكن تطبيق هذه الطريقة على دراسة أي مجمعات وحدة فرعية ديناميكية ترتبط بشكل عابر ببعض مكوناتها ، مثل الجسيم.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تصف هذه المقالة طريقة تثبيت التدرج، التي تستخدم الطرد المركزي للتدرج الجلسرين مع مثبت ترابطي لتحديد التفاعلات العابرة بين عوامل التضفير ومعقد المركب التضفيري. تعمل الطريقة على تثبيت التفاعلات البروتينية الفضفاضة دون تكوين ترسبات، مما يسهل دراسة التفاعلات البروتينية المحددة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- البيولوجيا الجزيئية
الخلفية
- تثبيت التدرج هي تقنية تُستخدم لدراسة التفاعلات البروتينية.
- تساعد في تحديد التفاعلات العابرة داخل مجمعات متعددة الوحدات.
- يعزز استخدام المثبتات الترابطية من استقرار هذه التفاعلات.
- تكون هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لدراسة عوامل التضفير.
هدف الدراسة
- لإظهار طريقة تثبيت التدرج لتحديد التفاعلات البروتينية.
- لتوفير بروتوكول يساعد المستخدمين لأول مرة في فهم التقنية.
- لتسهيل دراسة عوامل التضفير في الخميرة.
الطرق المستخدمة
- الطرد المركزي للتدرج الجلسرين مع مثبت ترابطي.
- إعداد المستخلصات الكلية للخميرة التي تعبر عن عوامل التضفير.
- جمع وخضوع خلايا الخميرة.
- تجميد تعلق الخلايا لمزيد من التحليل.
النتائج الرئيسية
- نجحت الطريقة في تثبيت التفاعلات البروتينية العابرة.
- تم تحديد تفاعلات محددة بين عوامل التضفير ومعقد المركب التضفيري.
- البروتوكول متاح للباحثين الجدد على التقنية.
- تساعد 示范 البروتوكول النهائي في الفهم العملي.
الخلاصات
- تثبيت التدرج هي طريقة فعالة لدراسة التفاعلات البروتينية العابرة.
- يمكن أن تعزز هذه التقنية فهمنا لآليات التضفير.
- توفر أداة قيمة للباحثين في البيولوجيا الجزيئية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Identifying transient protein interactions is critical for target validation in dynamic complexes like the spliceosome, where weak or short-lived associations can be missed by conventional methods. The Grafix (Gradient Fixation) method stabilizes these interactions using glycerol gradient centrifugation with a cross-linker, enabling detection without precipitate formation. This approach supports mechanistic de-risking by clarifying binding partners in disease-relevant systems, improving predictive confidence in early discovery stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transient splicing factor interactions that may represent therapeutic targets in RNA-processing pathways.
- Operational Value: Stabilizes weak binders for detection, reducing false negatives in target validation assays.
- Scientific Value: Supports pathway clarification by mapping co-sedimentation of factors like CWC 24 with U5 snRNP and NTC subunits.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares fractionated complexes for downstream analysis via dot blot, enabling quantitative assessment of splicing factor presence.
- Operational Value: Generates reproducible sedimentation profiles that can be standardized across runs for assay consistency.
- Scientific Value: Facilitates screening readiness by isolating subcomplexes in defined gradient fractions for targeted probing.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant insight into spliceosome dynamics, which are implicated in cancers and neurodegenerative disorders.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical validation by stabilizing transient interactions for functional follow-up.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by distinguishing stable versus transient associations in macromolecular machines.
Pipeline & Workflow Integration
The Grafix method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing of transient interactions before progressing to lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about transient splicing factor binding by stabilizing interactions for detection in gradient fractions.
- Screening: Produces assay-ready fractions with standardized glycerol gradients, enabling reproducible compound or factor screening.
- Analytics: Delivers quantitative sedimentation data and co-localization outputs (e.g., CWC 24 with Prp8/Prp19) to compare conditions and assess binding shifts.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by identifying factors whose transient binding may be modulated in disease states.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying any dynamic sub-unit complex with transient components, not limited to spliceosome.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by revealing transient interactors otherwise lost in standard lysates.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized gradient generation and fractionation, reducing variability across labs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by clarifying mechanistic ambiguity in multi-subunit target complexes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated interaction networks in disease-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast cell lysis, gradient preparation, and fractionation techniques.
- Depends on access to gradient master devices, swing bucket rotors, and fractionation equipment.
- Necessitates standardization of cross-linker concentration (e.g., glutaraldehyde) to avoid over-stabilization or precipitation.
- Involves adaptation considerations when applying to non-yeast systems or alternative complexes.
- Includes practical limitations such as potential epitope masking by cross-linking, requiring validation of antibody accessibility post-fixation.
![بروتوكول الأمثل لالكهربي التنقل التحول الفحص عن طريق أليغنوكليوتيد] وصفت صبغ الأشعة تحت الحمراء نيون](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F54863.jpg%3Fv%3D2026-07-03T19%253A36%253A14.000Z&w=384&q=75)
