تطبيق الماوس البارثينوجينيك Haploid الخلايا الجذعية الجنينية كبديل للحيوانات المنوية

يؤرخ هذا البروتوكول بشكل خاطئ تعديل البصمة الجينومية في الخلايا الجذعية الجنينية للفأر أحادي الصيغة الصبغية ، حيث يرجع موضوعنا إلى المنوية الكاذبة ، مما يتيح توليد أجنة محلية في الفئران. يتطلب التعديل الجيني للأمشاج عموما تقنيات صعبة. باستخدام هذه المنهجية ، يمكن التلاعب بالأمشاج الأبوية في خلايا جذعية جنينية هجينة لإدخالها لاحقا في الفئران كخيار بديل للحيوانات المنوية.

نظرا لأن هذه الطريقة تمكن من تعديلنا المصطنع المحدد للأمشاج الأبوية في الأجنة ، فهي قابلة للتطبيق بشكل خاص على دراسة البصمة الجينومية والكي. سيوضح هذا الإجراء تشارلز إتيان دومو ، عالم أجنة الفئران من مختبري. لتحضير ماصات التثبيت والحقن المجهري للتجربة، استخدم أولا مجتذب ماصة دقيقة لسحب الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات ذات الشكل الممدود وتفتق تدريجي.

لتحضير ماصات ثابتة، ضع شعيرات دموية مسحوبة بقطر خارجي يتراوح من 60 إلى 100 ميكرومتر في تشكيل دقيق فوق الخرزة الزجاجية على الفتيل. قم بتشغيل الفتيل وخفض الشعيرات الدموية حتى تلامس الخرزة. عندما تلتصق الشعيرات الدموية بالخرزة ، قم بإيقاف تشغيل الفتيل وسحب الشعيرات الدموية ، مما يتسبب في كسر الشعيرات الدموية بنهاية مستقيمة.

بعد ذلك ، ضع الطرف الشعري المكسور أفقيا بجوار الخرزة الزجاجية على الفتيل وقم بتسخين الفتيل لإذابة النهاية حتى يصل قطر القطر الداخلي للطرف الشعري إلى 10 إلى 20 ميكرومتر. ثم ضع الشعيرات الدموية فوق الخرزة الزجاجية على بعد ملليمتر واحد تقريبا من الحافة وقم بتسخين الفتيل للسماح بثني الشعيرات الدموية بزاوية 20 درجة. لتحضير ماصة حقن دقيقة ، ضع شعيرات دموية مسحوبة بقطر خارجي يبلغ حوالي ستة ميكرومتر فوق الخرزة الزجاجية على الفتيل الساخن وقم بخفض الشعيرات الدموية حتى تلامس الخرزة.

بمجرد أن يتم ربط الشعيرات الدموية ، قم بإيقاف تشغيل الفتيل وسحب الشعيرات الدموية. سوف تنكسر الشعيرات الدموية بنهاية مستقيمة. ثم حرك الشعيرات الدموية فوق الخرزة الزجاجية حوالي ملليمتر واحد من الطرف الشعري وقم بتسخين الفتيل للسماح بانحناء الشعيرات الدموية بزاوية 20 درجة.

لإجراء حقن داخل الهيولى ، ضع خمس قطرات ميكرولتر من محلول PVP و 20 قطرة ميكرولتر من وسط M2 على الغطاء المقلوب لطبق 10 سم وقم بتغطية القطرات بالزيت المعدني. ضع الطبق على المسرح وقم بتثبيت ماصة على جهاز المعالجة الدقيقة. استخدم طرف اللودر الدقيق لملء ماصة الحقن الدقيق بزيت الفلوروكربون وتركيب الماصة على مشغل بيزو.

عند المراقبة من خلال المجهر، قم بخفض ماصة الحقن المجهري في قطرة من محلول PVP. عندما يتم غمر الماصة، قم بتحريك الماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات لتغطية الزجاج باستخدام PVP. قم بتحميل كمية صغيرة من محلول PVP في ماصة الحقن المجهر.

اغمر الماصات بالحقن الدقيق وتثبيت الماصات في وسط M2 وركز على الماصة الموجودة أسفل القطرة. انقل ما يقرب من ميكرولترين من معلق الخلية الجذعية المزدوجة بالضربة القاضية إلى القطرة المتوسطة M2 واستخدم ماصة الفم لنقل 10 بويضات M2 إلى نفس القطرة. قم بتدوير بويضة واحدة وقم بالضغط السلبي من خلال الماصة المثبتة لتثبيت البويضة بحيث تواجه مساحة perivitelline ماصة الحقن المجهر، مع الحرص على عدم وضع اللوحة الطورية الثانية في مسار ماصة الحقن المجهر.

ارسم خلية ES مزدوجة الضربة القاضية في طرف ماصة الحقن المجهري وتأكد من تمزق غشاء الخلية. قم بتطبيق ضغط سلبي خفيف على ماصة الحقن المجهري وقم بتوصيل أربع نبضات بيزو أثناء دفع طرف ماصة الحقن المجهري باتجاه مساحة المحيط لاختراق المنطقة الشفافة. اخترق البويضة باستخدام ماصة الحقن المجهري بحيث تمتد الأوليما إلى الجانب الآخر وقم بتطبيق نبضة بيزو واحدة لاختراق الأوليما ، مع التأكد من أن الأوليما يرتاح على طول عمود ماصة الحقن المجهري.

قم بحقن خلية ES المنشأة بالضربة القاضية المزدوجة بحجم بسيط من الوسط في الأوبلازم واسحب ماصة الحقن المجهري بسلاسة من البويضة. حرر البويضة المحقونة من الماصة المثبتة وانقلها إلى جانب القطرة الدقيقة لجمعها لاحقا. عندما يتم حقن جميع البويضات ، انقل البويضات إلى طبق بئر مركزي مسخن مسبقا يحتوي على وسط KSOM واحتضان الطبق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة قبل التنشيط.

يوضح تحليل محتوى الحمض النووي لخط خلايا ES المزدوج التمثيلي ، الذي يحمل الجين المعدل CAG / EGFP عن طريق قياس التدفق الخلوي ، توزيع الخلايا أحادية الصيغة الصبغية وثنائية الصبغيات في مراحل G0 و G1 و S و G2 M. يمكن إجراء التنميط الجيني لتأكيد عدم وجود أليلات من النوع البري في H19 والمناطق الميثيلية التفاضلية بين الجينات. يمكن إدخال الجين المعدل CAG / EGFP في الخلايا الجذعية الجنينية المسببة للأمراض المزدوجة لدراسة مساهمتها في الأجنة شبه المستنسخة من خلال تصور التألق الأخضر تحت المجهر.

يظهر تحليل قياس التدفق الخلوي مجموعتين تتوافق مع المرحلة G2 M تم إيقاف الخلايا أحادية الصيغة الصبغية وثنائية الصبغيات بعد علاج demuculcene. يشير عدم وجود ذروة أحادية الصيغة الصبغية 1N إلى أن دورة راحة الخلية كانت كاملة إلى حد كبير. بعد الحقن ، نادرا ما يتم اكتشاف تعبير EGFP في الأجنة شبه المستنسخة المبنية.

حيث يتشتت سيتوبلازم الخلايا الجذعية القاتلة المزدوجة في السيتوبلازم الكبير للبويضة. بعد ست ساعات من التنشيط ، يمكن ملاحظة ما يصل إلى ثلاثة أجسام قطبية تحت المجهر. الأجسام القطبية الأولى والثانية للبويضة وجسم قطبي زائف واحد من ESC أحادي الصيغة الصبغية.

لإثبات كفاءتها التنموية ، يمكن زراعة الأجنة شبه المستنسخة إلى مرحلة الخلايا الأريمية. علاوة على ذلك ، يمكن الحصول على إناث الفئران كاملة المدة من أجنة شبه مستنسخة من مرحلتي الخلية المنقولة إلى قنوات البيض للإناث المتلقية. أثناء الحقن المجهري ، من المهم تمزيق غشاء البلازما للخلايا الجذعية الجنينية أحادية الصيغة الصبغية كما يظهر لمنع فصل الكروموسوم عند تنشيط البويضة.

بدلا من الخلايا الفردية أحادية الصيغة الصبغية ، يمكن أيضا استخدام خلايا ES أحادية الصيغة الصبغية الأندروجينية. السماح باختيار الأم أو الأم أو الأم كبديل للحيوانات المنوية اعتمادا على الغرض من الدراسة.