إجراءات استئصال الغدد و أخذ عينات الدم في نموذج تيليوست صغير الحجم الياباني ميداكا (Oryzias latipes)

ستساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بالوظيفة الفسيولوجية للغدد التناسلية ، بما في ذلك دور المنشطات الجنسية في مرونة نظام الغدد الصم العصبية وتنظيمها في teleosts وإلى حد كبير في الفقاريات. يتيح هذا البروتوكول إجراء استئصال الغدد التناسلية بمعدل نجاح مرتفع في نموذج teleost medeka الصغير ، والذي يستخدم على نطاق واسع في مجتمع البحث. من أجل النجاح وتحقيق معدل بقاء مرتفع ، تتطلب هذه التقنية تدريبا مناسبا ، لا سيما في تقييم الغدد التناسلية وخياطة الأسماك.

ابدأ بإخراج السمكة من محلول التخدير ووضعها أفقيا على جانبها تحت مجهر التشريح. لإجراء استئصال المبيض عند الإناث ، اكشط القشور في منطقة الشق. قم بعمل شق بلطف من 2 إلى 2.5 ملم بين الضلوع وزعانف الحوض والشرج باستخدام شفرة حلاقة.

اقرص بطن السمكة برفق أثناء إخراج المبايض باستخدام ملقط رفيع بطرف عريض. من المهم تجنب كسر الأضلاع التي يمكن أن تسبب الوفاة. نقطع نهاية المبايض بالملقط الناعم ونتركها جانبا.

لإجراء استئصال الأوركيد عند الذكور ، قم بعمل شق بين الأضلاع فوق فتحة الشرج وافتح الشق ببطء باستخدام ملقط دقيق. أمسك الخصيتين برفق بالملقط وأخرجهما ببطء. ثم قطع نهاية الخصيتين لإزالتها تماما.

بعد إجراء العملية ، قم بخياطة الشق بالمثل للذكور والإناث. ضع خيط النايلون بجانب منطقة الشق وطعن الجلد من الجانب الأيمن من الشق عبر تجويف الجسم الداخلي ، باستخدام ملقط فائق الدقة لأخذ الخيط فيه. بعد ذلك ، قم بثقب الجلد من الجانب الأيسر من الشق عبر تجويف الجسم الخارجي لإخراج الخيط.

أغلق فتحة الشق ، وقم بعمل عقدتين ، واقطع الخيط الزائد. ضع الأسماك في ماء الاسترداد متساوي التوتر ، واتركها هناك لمدة 24 ساعة على الأقل قبل نقلها إلى نظام الحوض. قم بتجميع درج الدم عن طريق ربط إبرة زجاجية بالشعيرات الدموية المصنوعة من السيليكون.

اكسر طرف الإبرة بملقط عريض وقم بتغطية الجزء الداخلي من الإبرة بمحلول مضاد للتخثر عن طريق الشفط والنفخ. قم بتوجيه الإبرة نحو منطقة السويقة من السمكة ، مستهدفا الوريد ذيلية السويقة ، واسحب الدم باستخدام الفم حتى يتم ملء ما لا يقل عن 1/4 من الحجم الكلي للإبرة. حرر الإبرة وضع قطعة من الشريط بالقرب من الجانب الحاد.

ضع غطاءا به ثقب على أنبوب التجميع وضع الإبرة داخل الأنبوب من خلال الفتحة مع طرف الإبرة من الخارج. ضع الأسماك في ماء الاسترداد واتركها هناك لمدة 24 ساعة على الأقل قبل نقلها إلى نظام الحوض. قم بتدوير الدم لمدة ثانية إلى ثانيتين عند 1,000 مرة جم لتجميع الدم في الأنبوب.

كان معدل البقاء على قيد الحياة بعد استئصال المبيض ، أو OVX ، عند الإناث 100٪ و 94٪ في الذكور بعد استئصال الأوركيد. نجت جميع الأسماك من إجراء أخذ عينات الدم. أظهرت الإناث التي تديرها الشام وضع OV.

تم تخصيب جميع البويضات وشرعت في التطور الجنيني. عندما تم إجراء عملية استئصال الغدد التناسلية بشكل صحيح ، تغير شكل جسم السمكة قليلا ، ولم يتبق أي قطع من الغدد التناسلية. اختفى الشق والخياطة تماما بعد أربعة أسابيع من استئصال الغدد التناسلية.

بعد أربعة أشهر ، لا تزال جميع الأسماك تظهر نمطا ظاهريا صحيا ولم يتم العثور على أنسجة الغدد التناسلية. كشف تحليل الدم عند الإناث أن مستوى E2 في أسماك OVX كان أقل بكثير من الأسماك التي يتم تشغيلها بشكل وهمي بعد 24 ساعة من الجراحة. بعد أربعة أشهر ، كان مستوى E2 في أسماك OVX لا يزال أقل بكثير من الأسماك التي يتم تشغيلها بشكل وهم.

أظهرت أسماك OVX جزئيا ، حيث تمت إزالة 1/3 إلى 1/2 فقط من الغدد التناسلية ، مستويات E2 أقل بكثير من الأسماك التي يتم تشغيلها بشكل وهم ، ومستويات E2 أعلى بكثير من أسماك OVX بالكامل. كان تركيز 11-KT في الذكور الأوركيتك أقل بكثير من الأسماك التي يتم تشغيلها بعد 24 ساعة من الجراحة. بعد أربعة أشهر ، كان مستوى 11 كيلوطنا لا يزال أقل منه في الأسماك التي يتم تشغيلها بشكل زائف.

أظهرت الأسماك الأوركيدية جزئيا مستويات أقل من 11 كيلو طن من الأسماك التي يتم تشغيلها بشكل وهمي ومستويات أعلى من الأسماك التي يتم استئصالها بالكامل. لضمان نجاح الإجراء ، من الضروري إزالة الغدد التناسلية بعناية وبشكل كامل قدر الإمكان ، دون الإضرار بالأعضاء الأخرى داخل السمكة. نظرا لأنه من المعروف أن المنشطات الجنسية تلعب دورا هاما في اللدونة الخلوية في الدماغ والغدة النخامية, توفر هذه التقنية أداة قوية للتحقيق في الآليات الكامنة في نماذج teleost الصغيرة.