إعداد عينة للتنميط الأيضي باستخدام التصوير الطيفي الشامل MALDI

قياس الطيف الكتلي للتصوير MALDI تقدما فريدا في مجال التمثيل الغذائي الذي يسمح لنا بقياس وتصور وفرة مستقلبات الأيض النسبية وتوزيعها ، والتي تدل على الكائنات الحية والظروف الفسيولوجية والمرضية. الميزة الرئيسية ل MALDI Imaging هي قدرتها على اكتشاف المستقلبات في C2 دون الحاجة إلى وضع العلامات. لتوضيح الإجراء ، لدينا سامي سوما ، طالب دراسات عليا من مختبر الدكتورة باتريشيا كاسيتا.

يوكي تشين وكيلي فيراسامي ، طلاب باحثين من مختبري. بعد الحصاد ، ضع الأنسجة على الفور في قارب رقائق الألومنيوم السائل المبرد وصندوق البوليسترين. قم بإحاطة غطاء صندوق البوليسترين لتجميد الأنسجة لمدة 2 إلى 10 دقائق ، وفقا لحجم الأنسجة.

عندما يتم تجميد الأنسجة بشكل كاف ، استخدم الملقط لإزالة القارب ونقل الأنسجة المثبتة داخل الرقاقة على الثلج الجاف إلى ناظم البرد. قبل تقسيم الأنسجة ، مع الحرص على عدم التنفس على الشرائح. استخدم القفازات ومقياس الفولت المضبوطة على المقاومة لاختبار موصلية العدد المناسب من الشرائح الزجاجية المطلية بأكسيد القصدير الإنديوم المتوافقة مع MALDI للتحليل.

بعد وضع الملصقات ، ضع الشرائح على منشفة ورقية نظيفة وضبط ناظم ناظف من الإيثانول بنسبة 70٪ على 20 درجة مئوية تحت الصفر. ضع عينة الأنسجة في ناظم البرد واضبط درجة حرارة حجرة ناظم التبريد ورأس العينة ، وفقا لنوع الأنسجة. بعد السماح للأنسجة بالتوازن لمدة 30 دقيقة ، استخدم مركب تضمين الأنسجة المجمدة لتركيب الأنسجة على الظرف

ووضع شفرة نظيفة وأغلقها في المسرح ، واضبط موضع المسرح وزاوية العينة لتحقيق زاوية القطع المطلوبة. وقسم الأنسجة حتى يتم الكشف عن منطقة الاهتمام. عند الوصول إلى المنطقة المطلوبة ، احصل على أقسام بسمك 10 إلى 12 ميكرون ، باستخدام فرشاة مبردة مسبقا بعناية ، ولكن بسرعة اجمع كل قسم على الجانب المسمى من كل شريحة عند الحصول عليها.

ضع إصبعا أسفل الشرائح لتدفئة الأقسام ، لضمان التثبيت الآمن على الشريحة. ستصبح الأقسام شفافة في غضون 5 إلى 10 ثوان وتتحول إلى معتمة بعد حوالي 30 إلى 60 ثانية. عندما يتم جمع جميع الأقسام ، ضع الشرائح في حامل الشريحة واحمل الثلج الجاف إلى مزيل الفصل.

بدلا من ذلك ، يمكن حمل الشرائح في صندوق مفرغ من الهواء. ضع الشرائح في مدنس مع مجفف وجفف الشرائح بالمكنسة الكهربائية لمدة 45 إلى 60 دقيقة. بعد التجفيف ، إذا لم يتم استخدامه على الفور ، ضع الشرائح في ناقل الشرائح واملأ الناقل بالنيتروجين.

أغلق الحامل بالبارافيلم وضع الحامل في كيس مضغوط. ثم ضع الكيس المضغوط الأول في كيس مضغوط ثان يحتوي على مادة مجففة لتخزين 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة تصل إلى ستة أشهر. بعد الجفاف ، استخدم علامة فضية غامقة لوضع علامات X على المساحات الفارغة للشرائح خارج أقسام الأنسجة واستخدم علامة نقطة دقيقة سوداء لوضع علامة X سوداء ثانية فوق كل X فضي ، قم بتحميل شريحة واحدة في الهدف المعدني للشريحة MALDI وضع غطاء بلاستيكي فوق الشريحة.

حدد موقع العينة على الغطاء البلاستيكي وضع الشريحة وهدف MALDI على سطح الماسح الضوئي المسطح. ثم قم بمعاينة الشريحة وحدد المنطقة المطلوبة. امسح الشريحة ضوئيا بمقياس رمادي 16 بت ، بمعدل 2 ، 400 نقطة في البوصة واحفظ الصورة لاستخدامها لاحقا.

لتطبيق المصفوفة على الشرائح ، قم بتشغيل وحدة بخاخ المصفوفة الأوتوماتيكية ، وتأكد من وضع الصمام عند الحمل ، وقم بتشغيل برنامج البخاخ. تأكد من أن مروحة العادم تعمل بشكل صحيح وتأكد ضمن علامة تبويب الاتصالات أن النظام يتصل بشكل صحيح. ابدأ تشغيل مضخة المذيبات بمعدل 100 ميكرولتر في الدقيقة بضغط خلفي يبلغ حوالي 500 رطل لكل بوصة مربعة.

واضبط خزان النيتروجين على 30 رطلا لكل بوصة مربعة لبدء تدفق الهواء المضغوط إلى بخاخ المصفوفة. اضبط منظم الضغط في مقدمة البخاخ على 10 أرطال لكل بوصة مربعة ، واضبط درجة حرارة فوهة البخاخ حسب الرغبة. باستخدام الصمام وموضع الحمل ، استخدم المحقنة لغسل الحلقة بسبعة ملليلتر من 70٪ من الميثانول قبل ملء الحلقة بستة ملليلتر في مصفوفة.

ضع شريحة زجاجية فارغة في الحامل والبخاخ ، وقم بلصق كلا الطرفين لمنع الحركة والتحقق من استقرار معدل التدفق ودرجة الحرارة. اضغط على ابدأ لضبط درجة حرارة الفوهة ولضبط معدل تدفق المضخة ، لتتناسب مع الطريقة المحددة. قم بتبديل الصمام من الحمل إلى الرش وانقر فوق متابعة.

سمح للنظام بالعمل حتى الانتهاء. عند الانتهاء من الترسيب ، قم بتبديل الصمام من الرش إلى الحمل وانقر فوق متابعة. افحص نمط ترميز المصفوفة تحت المجهر.

إذا لوحظت طبقة متساوية من بلورة المصفوفة الدقيقة ، فقم بإيداع المصفوفة على شرائح العينة المناسبة كما هو موضح للتو. عندما تتم معالجة جميع الشرائح ، قم بتنظيف النظام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لمنع انسداد فوهة البخاخ. هنا ، يتم عرض صور الإخراج من تحليل بيانات MALDI MS Imaging لأطياف التفريغ الكتلي المختارة من كل فاصل زمني 100 دالتون ، والتي تصور بوضوح فائدة تحديد الأطياف من مستقلبات الجزيئات الصغيرة إلى الدهون ذات الوزن الجزيئي المرتفع.

يصور كل طريق خرائط حرارية أيونية محترمة تحتوي على معلومات مكانية والطيفية لنوع معين من المستقلب عبر ثلاثة أنسجة تم جمعها في أيام ما بعد الولادة 1 و 21 و 60. تتمثل إحدى نقاط قوة منهجية MALDI MSI في القدرة على تمييز خصوصية أنواع معينة تم تحديدها من خلال نسبة الكتلة إلى الشحنة إلى المعالم التنموية أو الهياكل التشريحية المحددة. في هذا التحليل ، لوحظ أن بعض المستقلبات يتم إثرائها في حديثي الولادة في اليوم الأول بعد الولادة أو 60 بالغا بعد الولادة ، أو ليتم توزيعها بشكل موحد عبر الأعمار المختبرة.

لوحظ أن الأنواع الجزيئية الأخرى غنية على وجه التحديد بالمادة الرمادية أو المادة البيضاء أو السائل النخاعي الدماغي والبطينين. كما تم تحليل التوزيع المكاني للمستقلبات التمثيلية ، بما في ذلك هيبوكسانثين وحمض الجلوتاميك وحمض الأسبارتيك N-acetyl وحمض الأراكيدونيك والعديد من الدهون. للحفاظ على دقة ستاتا التمثيل الغذائي ، يعد تشريح العينة المناسب والتخزين وتقسيم cyro أمرا بالغ الأهمية لمنع التغيرات الأيضية الاصطناعية.

بعد إجراء تجربة MALDI الخاصة بك ، قد ترغب في التحقق من هويات المستقلبات التي وجدتها. يمكن تحقيق ذلك عن طريق استخراج ميركو والكروماتوغرافيا السائلة جنبا إلى جنب مع مرض التصلب العصبي المتعدد. يسهل MALDI MS Imaging الاستفسار القائم على التمثيل الغذائي مع الدقة المكانية ويتيح للباحثين الفرصة للتأكد من البيانات الأيضية في وسيط كمي ومرئي. هناك الكثير من الاهتمام مؤخرا بتأثير النظام الغذائي على الاضطرابات التنكسية العصبية ، والعلاقة بين ميكروبيوم الأمعاء والدماغ.

وهكذا كانت هناك أهمية هائلة لدراسة التمثيل الغذائي في علم الأعصاب ، من التطور العصبي إلى التنكس العصبي. الحقيقة الرئيسية للتفاعل بين الأمعاء والدماغ. وفي هذا السياق ، يمكن لفكرة منشأة MALDI Imaging أن توفر حقا تقنيات متميزة لتصور التأثير الذي قد يحدثه تلاعب معين في الدماغ.