تصنيع منصات مغناطيسية لتنظيم Micron-Scale للخلايا العصبية المترابطة

نهجنا يجعل من الممكن السيطرة على تشكيل الشبكة العصبية باستخدام التلاعب المغناطيسي. هذه أداة فعالة للدراسات المختبرية للشبكات وتقدم اتجاها علاجيا جديدا لأجهزة التدخل الحيوي. مع هذه التقنية يمكننا التحكم في كل من موقع الخلية والنمو على مقياس ميكرون، مما يسمح بتصميم مرن للنمط المغناطيسي وبالتالي تنظيم الشبكة.

كفاءة وغير سامة الجسيمات النانوية المغناطيسية steriloptic أمر بالغ الأهمية. لتحقيق النجاح، هناك حاجة إلى جسيمات نانوية مغناطيسية مناسبة. الميزات الهامة هي حجم، والطلاء، وقيمة مغنطة الوضع.

إثبات الإجراءات سيكون (روت بلين) و(دافنا ليفنبرغ)، طلاب ماجستير في مختبري. للبدء، قطع الشرائح الزجاجية إلى قطعتين في سنتيمترين باستخدام قلم كاتب. تنظيف الشرائح الزجاجية في الأسيتون ثم isopropanol لمدة خمس دقائق لكل منهما في حمام ultrasonication.

ثم جففها بالنيتروجين عالي النقاوة. معطف الزجاج مع فوتوريستر باستخدام طلاء تدور في 6،000 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية لتحقيق سمك 1.5 ميكرومتر وخبز 100 درجة مئوية لمدة 60 ثانية. يعرض العينة إلى مصدر ضوئي باستخدام قناع ضوئي أو رسم مطبوع بدون قناع لتحقيق النمط المطلوب.

تطوير العينة لمدة 40 ثانية في مطور مخفف في الماء المقطر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ثم يغسل في الماء لمدة 45 ثانية وتجفيفه مع غاز النيتروجين UHP. فحص النمط تحت المجهر البصري.

أدخل العينة في غرفة قفل التحميل في نظام الترسب وانتظر الضغط الأساسي. نقل العينة في الغرفة الرئيسية وتعيين العينة في الارتفاع المناسب للترسب. زيادة القوة على كل هدف حتى يتم تحقيق المعدل المطلوب.

بدوره على التناوب، ثم إيداع متعدد الطبقات المغناطيسية الحديدية، بالتناوب بين أهداف الكوبالت والحديد والبلاديوم عن طريق فتح وإغلاق مصاريع الهدف على التوالي. إيداع 14 طبقة ثنائية من البلاديوم الحديد الكوبالت والانتهاء مع طبقة إضافية توج البلاديوم. بعد اكتمال الترسب، قم بتفريغ العينة من نظام الترسب.

نقع العينة في الأسيتون لمدة 30 دقيقة وشطفه مع ايزوبروبانول. ثم يجففه بالنيتروجين UHP وفحصه تحت المجهر. يبقيه في بيئة نظيفة وجافة حتى الاستخدام.

استخدام شريحة زجاجية مع شريط مغناطيسي على شكل صليب من عرض 100 ميكرومتر المودعة مع طبقات متعددة المغناطيسية. إرفاق العينة إلى حامل باستخدام الشريط على الوجهين. استخدام سلك المستعبدين لسندات أربعة أسلاك للعينة، واحد على كل ساق من القطب الصليب.

تعيين حامل العينة وعينة داخل نظام قياس النقل مع مجال مغناطيسي بحيث يكون المجال المغناطيسي عموديا على العينة. إجراء قياسات الجهد العرضي كما هو موضح في المخطوطة النصية. تمشيط المجال المغناطيسي وقياس الجهد العرضي كدالة للحقل.

رسم المقاومة العرضية كدالة للمجال المغناطيسي لتحديد إشارة القاعة الشاذة ، والتي تتناسب مع المغناطيسية المتعامدة في الفيلم. إعداد متوسط النمو الأساسي ووسيط التمايز لثقافة خلايا PC12 كما هو موضح في مخطوطة النص. تنمو الخلايا في قارورة ثقافة غير المعالجة مع 10 ملليلتر من متوسط النمو الأساسي، إضافة 10 ملليلتر من المتوسط إلى القارورة كل يومين إلى ثلاثة أيام.

زراعة الخلايا الفرعية بعد ثمانية أيام. لامتصاص الخلوية، الطرد المركزي تعليق الخلية لمدة ثماني دقائق في 200 G ودرجة حرارة الغرفة، ثم تجاهل supernatant. إعادة إنفاق الخلايا في ثلاثة ملليلتر من متوسط النمو الأساسي الطازج.

الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى لمدة خمس دقائق، ثم تجاهل supernatant وإعادة إنفاق الخلايا في ثلاثة ملليلتر من وسيط التمايز الطازجة. يستنشق الخلايا 10 مرات باستخدام حقنة وإبرة لتفريق مجموعات الخلايا ، ثم عد الخلايا باستخدام مقياس الدم وزرع مليون خلية في طبق منتظم غير مطلي عيار 35 ملليمترا. إضافة الحجم المحسوب لتعليق MNP والتمايز المتوسطة إلى الطبق لتحقيق تركيز MNP المطلوب.

خلط الخلايا، MNPs، والتمايز المتوسطة، ثم احتضان الطبق في حاضنة 5٪ ثاني أكسيد الكربون الرطوبة في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. تنظيف الركيزة منقوشة مع 70٪ الإيثانول ووضعه في طبق ثقافة 35 ملليمتر في غطاء محرك السيارة. ضع مغناطيسا كبيرا أسفل الركيزة المنقوشة لمدة دقيقة واحدة ، ثم قم بإزالتها عن طريق تحريك الطبق صعودا وبعيدا وإخراج المغناطيس من غطاء محرك السيارة.

قم بتشغيل الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة. لإعداد ركيزة زجاجية مغلفة بالكولاجين، قم بتخفيف نوع الكولاجين بنسبة 1 إلى 50 في الإيثانول بنسبة 30٪. تغطية الزجاج مع الحل.

اترك الطبق مكشوفا في غطاء محرك السيارة لمدة أربع ساعات حتى يتبخر كل المحلول ، ثم اغسله ثلاث مرات في PBS معقم. إزالة الخلايا من الحاضنة، والطرد المركزي تعليق الخلية لمدة خمس دقائق في 200 G والتخلص من supernatant. إعادة إنفاق الخلايا في ملليلتر واحد من وسط التمايز الطازجة وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم.

البذور 10 إلى خمس خلايا فوق الركيزة في طبق ثقافة 35 ملليمتر وإضافة اثنين من ملليلتر من وسيطة التمايز. احتضان الثقافة في حاضنة مرطبة لثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية. بعد 24 ساعة، إضافة واحدة إلى 100 جديد مورين بيتا-NGF إلى الخلايا.

تجديد وسيط التمايز وإضافة جديدة بيتا-NGF كل يومين. صورة الخلايا كل يومين باستخدام المجهر الخفيفة وأداء المناعة على الخلايا بعد تشكيل الشبكة. تم تصنيع منصات مغناطيسية ذات أشكال هندسية مختلفة وتم تصنيع MNPs أكسيد الحديد الفلوري بواسطة النوى.

وتبين القياسات المغناطيسية للنواب أن منحنى المغنطة لم يكن به نجمة، وحقل تشبع منخفض، وتشبع مغناطيسي مرتفع نسبيا. تم احتضان خلايا PC12 في المتوسط مختلطة مع MNPs الفلورية أكسيد الحديد، وتحويلها إلى وحدات مغناطيسية. تم استيعاب أعضاء البرلمان في الخلايا 'سوما، ولكن ليس في النوى.

ازداد تركيز الحديد داخل الخلايا مع زيادة تركيز MNP في الوسط. تم تقييم صلاحية خلايا PC12 المحملة من MNP لتركيزات مختلفة من MNPs من خلال مقارنة المعلمات المورفولوجية للخلايا المحملة MNP باستخدام تحليل Shoal ، مما لا يظهر أي فرق عن خلايا التحكم. أكدت المقايسات المستندة إلى XTT و Resazurin أن التركيزات المقيمة ل MNPs لم تظهر أي سمية خلوية كبيرة تجاه الخلايا.

نمت خلايا PC12 مع وبدون العلاج MNP ومتمايزة على الركيزة المغناطيسية. تم العثور على الخلايا المغنطة لإرفاق الأنماط المغناطيسية وتنمو الفروع وفقا للأنماط، في حين نمت الخلايا دون علاج MNP مع أي تقارب مع الأجهزة المغناطيسية. يظهر هنا تحديد مواقع الخلايا على الركيزة ذات الهندسة السداسية.

75٪ من جسم الخلية المحملة MNP كانت على اتصال مع المشارب المغناطيسية، في حين أن 35٪ فقط من الخلايا غير المغناطيسية كانت موجودة على المشارب. بالإضافة إلى تأثير تحديد موقع الخلية ، تم العثور على هذه المنصات المغناطيسية للتحكم في اتجاه النيوريت المتنامي. لتقييم التأثير المغناطيسي على اتجاه نمو الخلايا العصبية ، تم قياس الزاوية بين النيوريت والمشارب المغناطيسية ، مما يدل على ارتباط كبير مع اتجاه المشارب المغناطيسية.

يتم تكييف هذا الإجراء بسهولة لتوجيه المركبات النشطة ، مثل الأدوية ، بعد اقترانها بالجسيمات النانوية المغناطيسية. ويمكن ترجمة إلى ارتفاع الإنتاجية فحص المخدرات المقايسات أو العلاج المحلي داخل الأنسجة. هذا النهج الجديد يفتح إمكانيات جديدة لوظيفية الركائز أو الأجهزة الأخرى عن طريق إضافة هياكل جذابة المغناطيسي.

حاليا، ونحن على تطوير تحسين واجهات رقاقة الخلايا العصبية المتوافقة بيولوجيا.