وضع العلامات والتصور لمنتجات التعبير الجينوم الميتوكوندريا في خميرة بيكر Saccharomyces cerevisiae
April 11th, 2021
جينوم الخباز للخميرة الميتوكوندريا يرمز ثمانية من البوليبتيدات. الهدف من البروتوكول الحالي هو تسمية كل منهم وتصورها بعد ذلك كشرائط منفصلة.
الميتوكوندريا هي العضيات الأساسية للخلايا eukaryotic قادرة على التنفس الهوائية. خللهم الوظيفي هو مصدر معروف للأمراض البشرية. بيكر الخميرة الميتوكوندريا يحتوي على الجينوم الدائري ترميز ثمانية بروتينات.
في هذا الفيديو، وصفنا البروتوكول المستخدم في فحص التمثيل الحيوي للبروتين في الميتوكوندريا الخميرة عن طريق وضع العلامات المشعة للمنتجات التحويلية والفصل اللاحق عن طريق إلكتروفورسيس هلام. يتضمن الإجراء عدة خطوات رئيسية. خميرة متتالية من ثقافات الأسهم المجمدة على لوحات طازجة مع المتوسط المناسب.
وضع لوحات في حاضنة الثقافة في 30 درجة لمدة 24 إلى 48 ساعة. تلقيح هذه الثقافات في اثنين من ملليلتر من المتوسط من خط جديد في أنبوب 15 ملليلتر واحتضان لهم بين عشية وضحاها التحريض في 200 دورة في الدقيقة في 30 درجة. قياس الكثافة البصرية للثقافة عند الطول الموجي ل 600 نانومتر.
تأخذ حجم المقابلة لوحدات امتصاص 0.2 في أنابيب معقمة لوحة خلايا الخميرة في 9, 000 G لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. تجاهل هذا العملاق. غسل الخلايا مع 0.5 ملليلتر من الماء العقيم عن طريق الدوامة لمدة خمس ثوان.
خلايا الخميرة Pallette في 9، 000 G لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. تجاهل الناتنات الفائق. تمييع الخلايا في اثنين من ملليلتر من مسح الطازجة agar المتوسطة.
حافة الحضانة التي اتخذت في 200 دورة في الدقيقة و 30 درجة حتى تصل الكثافة البصرية من 1.5 إلى 1.9 من 1.5 إلى 1.9 القيم. نقل حجم الثقافة المكافئ لوحدة بصرية واحدة في أنبوب الطرد المركزي الصغير. تدور الأنابيب في 3000 غرام لمدة دقيقة واحدة.
تجاهل الناتنات الفائق. غسل الخلايا مع 0.5 ملليلتر من الماء العقيم عن طريق الدوامة لمدة خمس ثوان. خلايا الخميرة Pallette في 9، 000 G لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة تجاهل supernatant.
إعادة تعليق خلايا الخميرة في 0.5 ملليلتر من العازلة الترجمة العقيمة. ضع التعليق في أنبوب 15 ملليلتر. إضافة cycloheximide إلى تعليق الخلية تصل إلى التركيز النهائي من 0.2 ملليغرام لكل حضانة ملليلتر لمدة خمس دقائق الحافة التي اتخذت في 200 دورة في الدقيقة و 30 درجة لمنع الترجمة الخلوية.
إضافة من 25 إلى 30 إضافة من 25 إلى 30 ميكروكوري من S35 ميثيونين من S35 ميثيونين لتعليق الخلية واحتضان لمدة 30 دقيقة حافة اتخذت في 200 دورة في الدقيقة و 30 درجة. إضافة methionine الباردة unlabeled وborymycin لوقف حضانة وضع العلامات لمدة 10 دقائق حافة اتخذت في 200 دورة في الدقيقة و 30 درجة. جمع خلايا الخميرة عن طريق الطرد المركزي في 9، 000 G لمدة 30 ثانية.
غسل الخلايا مع 0.5 ملليلتر من الماء العقيم عن طريق الدوامة لمدة خمس ثوان. خلايا الخميرة Pallette في 9، 000 G لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. تجاهل الناتنات الفائق.
إضافة 75 ميكرولتر من العازلة تحلل إلى لوحة دوامة لمدة خمس إلى 10 ثانية. إضافة 500 ميكرولتر من 0.5 الأضراس تريس العازلة من 0.5 الأضراس تريس العازلة مع pH 6.8. مع رقم الحموضة 6.8.
دوامة لفترة وجيزة. إضافة 600 ميكرولتر من الميثانول إلى العينة. دوامة لمدة خمس ثوان.
إضافة 150 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى العينة. دوامة لمدة خمس ثوان. الطرد المركزي العينات لمدة دقيقتين في 12، 000 G.Carefully تجاهل opaface مع أخذ العينات.
إضافة 600 ميكرولتر من الميثانول إلى العينة. مزيج بعناية عن طريق عكس الأنبوب عدة مرات. عينات الطرد المركزي لمدة دقيقتين في 12،000 G.Discard supernatant.
يجفف الهواء البالتات لمدة دقيقتين عند 80 درجة. حل البروتينات عجلت في 60 ميكرولتر من Laemmli عينة العازلة. سخني العينات لمدة 10 دقائق عند 14 درجة.
السبب في هلام البولي أكريلاميد 17.5٪. تحميل 15 ميكرولتر من كل عينة في جيوب. تشغيل هلام في غرفة باردة حتى الصبغة الزرقاء تصل إلى ما يقرب من 65٪ من الليمفاوية هلام.
وصمة عار الجل مع كوماسي الأزرق الرائعة وجعل المسح الضوئي أو الصورة التي هي مطلوبة كتحكم التحميل. جفف الجل في مجفف الجل. يبقيه في كاسيت مع شاشة تخزين الفوسفور لمدة ثلاثة إلى خمسة أيام.
مسح الشاشة على صور الفوسفور. بعد البروتوكول المذكور أعلاه ، خصصنا منتجات ترجمة الميتوكوندريا من سلالات Saccharomyces cerevisiae. نوع البرية وحذف البديل متحولة من الجين Aim23 ترميز الميتوكوندريا عامل بدء الترجمة ثلاثة.
تم بالفعل تسمية منتجات الترجمة الميتوكوندريا وفصلها بنشاط في هلام البولي أكريلاميد. تم جمع العينات كل دقيقتين ونصف قبل التشبع لبناء الدورة الزمنية. كان الجل ملطخا ومجففا ويتم فحصه بعد المعرض الذي أقيم لمدة خمسة أيام.
في حالة تجربة ناجحة ، تظهر الصورة ثمانية نطاقات مخصصة وفقا للنمط القياسي. ومع ذلك ، يمكن أن تكون كثافة النطاقات الفردية متغيرة للغاية اعتمادا على السلالة والظروف التجريبية. يتوافق كل نطاق مع منتج ترجمة واحد.
وتشير البيانات إلى أن سلالة متحولة قادرة على تخليق البروتين الميتوكوندريا لأن جميع المنتجات التي تظهر في نوع البرية مرئية في هذا متحولة. ومع ذلك ، فإن كثافة العصابات تختلف عن النوع البري ، مما يعني أن هذا الحذف من Aim23 يؤثر على التعبير الجيني الميتوكوندريا. Kumasi تختمر في وصمة عار زرقاء وبمثابة عنصر تحكم التحميل.
ويمكن قياس نتائجها في البيانات لتحديد الاختلافات بين السلالات أو الظروف التجريبية باستخدام صورة G أو صورة كوان البرمجيات. بالنسبة لهذه، يتم حساب نسبة الإشارة المقابلة لكل منتج إلى إجمالي الإشارة. يتم حساب متوسط القيم والانحرافات المعيارية في ثلاث تجارب مستقلة على الأقل.
تتم دراسة حركية البروتين المركب الذي تم تسليمها في تجربة العام الماضي. يتم جمع العينات في النقاط الزمنية المشار إليها بعد توقف رد فعل وضع العلامات عن طريق الميثيونين البارد والبوريميسين. عنصر التحكم هذا ضروري لتقدير استقرار المنتج.
تلطيخ المناعة مع مكافحة بورين الأجسام المضادة واحد هو التحكم في التحميل. وصفنا هذه الطريقة، والتي غالبا ما تستخدم لدراسة التمثيل الحيوي البروتين في الميتوكوندريا الخميرة. هذا البروتوكول بسيط نسبيا وسريع الأداء.
في الوقت نفسه، فإنه يسمح للحصول على معلومات قيمة حول معدل الترجمة من أربعة MRNAs الميتوكوندريا الخميرة، وهو أمر مفيد للغاية. ومع ذلك، لديها العديد من القيود التي تتطلب تجارب إضافية وتقع في هذه المستويات بين الولايات من البروتينات والرنانات. يمكن أن توفر المعلومات حول هذه الوظائف في نظام الترجمة الميتوكوندريا، ولكن ينبغي استخدام تقنيات أكثر تقدما لاكتشاف الآلية.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تصف هذه المقالة بروتوكولاً لتسمية وتصور ثماني ببتيدات مشفرة بواسطة الجينوم الميتوكوندري للخميرة الباكرية. تتضمن الطريقة تسمية إشعاعية للمنتجات الانتقالية تليها رحلان كهربائي على هلام.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- الوراثة
الخلفية
- الميتوكوندريا ضرورية للتنفس الهوائي في الخلايا حقيقية النواة.
- يرتبط خلل الميتوكوندريا بالعديد من الأمراض البشرية.
- تحتوي الخميرة الباكرية على جينوم ميتوكوندري دائري.
- يشفر هذا الجينوم ثماني بروتينات أساسية.
غرض الدراسة
- تسمية جميع الببتيدات المشفرة بواسطة جينوم الخميرة الميتوكوندري.
- تصور هذه الببتيدات كحزم منفصلة.
- تعزيز فهم التخليق الحيوي للبروتين الميتوكوندري.
الطرق المستخدمة
- التسمية الإشعاعية للمنتجات الانتقالية.
- فصل البروتينات الموسومة باستخدام رحلان كهربائي على هلام.
- توزيع الخميرة من ثقافات المخزون المجمدة على أطباق جديدة.
- استخدام الوسط المناسب لنمو الخميرة.
النتائج الرئيسية
- تسمية ناجحة لجميع الثماني ببتيدات الميتوكوندري.
- تصور الببتيدات كحزم متميزة على هلام.
- تدليل على فعالية البروتوكول في مقايسات التخليق الحيوي للبروتين.
- أفكار حول وظيفة الميتوكوندريا وتخليق البروتين.
الاستنتاجات
- البروتكول يعين ويصور البروتينات الميتوكوندريا بشكل فعال.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة في الدراسات المستقبلية على وظيفة الميتوكوندريا.
- فهم هذه العمليات حيوي لمعالجة الأمراض الميتوكوندريا.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Quantitative labeling and visualization of mitochondrial translation products in Saccharomyces cerevisiae enables precise interrogation of mitochondrial gene expression and protein biosynthesis. This capability is critical for mechanistic de-risking in early discovery, particularly when evaluating the impact of genetic perturbations on organellar function. The method supports portfolio decisions by providing robust, comparative data on mitochondrial translation across wild-type and mutant strains.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of mitochondrial translation rates for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing effects of genetic modifications on mitochondrial protein synthesis.
- Facilitates comparative analysis between wild-type and mutant strains to clarify pathway dependencies.
Screening & Assay Development
- Provides a validated workflow for isolating and quantifying mitochondrial translation products.
- Delivers reproducible, quantitative banding patterns for assay standardization and downstream screening.
- Enables reliable detection of biosynthetic defects for compound or genetic screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial translation outputs with disease-relevant models when mitochondrial dysfunction is implicated.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by enabling quantitative assessment of mitochondrial gene expression.
- Provides mechanistic insight into translation defects relevant to mitochondrial pathobiology.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical model validation, where mitochondrial function is a key readout.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying translation of mitochondrial-encoded proteins under different genetic backgrounds.
- Screening: Offers reproducible, quantitative outputs for comparing biosynthetic rates across conditions.
- Analytics: Enables statistical analysis of band intensities to compare translation efficiency and stability.
- Translational Research: Connects mitochondrial translation data to disease-relevant phenotypes in yeast models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for mitochondrial translation analysis across multiple genetic or pharmacological interventions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in mitochondrial target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible workflows for mitochondrial translation analysis.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing quantitative, comparative data on mitochondrial biosynthesis.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and models based on mitochondrial translation outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast genetics, radiolabeling, and protein electrophoresis.
- Needs access to phosphorimaging and quantitative gel analysis infrastructure.
- Demands rigorous controls and replication to ensure data reliability and cross-team comparability.
- Adaptation to other model systems may require protocol optimization for translation specificity.
- Interpretation of translation rates must consider additional experiments for mechanistic conclusions.
