باستخدام Immunofluorescence للكشف عن PM2.5-الناجم عن تلف الحمض النووي في قلوب الأجنة حمار وحشي
فبراير 15, 2021
يستخدم هذا البروتوكول فحص المناعة للكشف عن تلف الحمض النووي الناجم عن PM2.5في القلوب التشريحية لأجنة حمار وحشي.
يمكن استخدام هذه الطريقة للكشف بدقة وسهولة عن التعبير عن البروتينات المستهدفة في قلب حمار وحشي. يتم الكشف عن التغير في البروتين المستهدف مباشرة عن طريق قياس الفلورسينس المناعي. إجراء جمع جنين حمار وحشي وعلاجه، كما هو موضح في المخطوطة النصية.
في 72 ساعة بعد الإخصاب، نقل الأجنة إلى الشرائح الزجاجية، ومراقبتها تحت المجهر ستيريو. سجل تشوهات القلب، مثل وذمة التامور، وتغيير الحلقات وانخفاض الحجم. احسب معدلات التشوه وحلل الاختلافات بين المجموعات باستخدام طريقة واحدة ل ANOVA، يليها اختبار المقارنة المتعدد في تركيا.
بعد تخدير الأجنة مع 0.6 ملليغرام لكل ملليلتر MS222، سجل ضربات القلب لمدة 30 ثانية، وتحديد معدلات ضربات القلب باستخدام برنامج Image J. تشريح بعناية قلوب من أجنة السمك حمار وحشي مع إبرة حقنة المتاح تحت المجهر ستيريو. استخدم قلم حاجز مسعور لرسم دائرة على شريحة زجاجية نظيفة.
إضافة 50 ميكرولتر من 4٪ paraformaldehyde إلى 1.25 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لجعل حل التثبيت، ثم وضع ثلاثة قلوب تشريح في دائرة حاجز واحد الكاره للماء، واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. decant الحل تحت المجهر وتجفيف العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق على الأقل. غسل الشرائح ثلاث مرات في PBST لمدة خمس دقائق لكل غسل.
إضافة 50 ميكرولتر من BSA إلى 1000 ميكرولتر من PBST للحصول على حل 5٪ BSA، واحتضان الشرائح في غرفة رطبة لمدة ساعة واحدة لمنع ربط الأجسام المضادة غير محددة. decant الحل وغسل العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق لكل غسل. تمييع اثنين من microliters من الأجسام المضادة أحادية النسيلة الماوس ضد 8-هيدروكسيدوكسيجوانوزين واثنين من microliters من الأجسام المضادة متعددة النسيلة أرنب ضد غاما-H2AX في 296 ميكرولتر من PBST للحصول على حل كوكتيل الأجسام المضادة الأولية العاملة.
احتضان عينات القلب مع 50 ميكرولتر من محلول كوكتيل الأجسام المضادة الأولية في غرفة رطبة لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. decant الحل وغسل العينات ثلاث مرات مع PBST لمدة خمس دقائق لكل غسل. تمييع واحد microliter من FITC المسمى الماعز المضادة للفأرة الأجسام المضادة الثانوية وmicroliter واحد من الماعز psy-3 المضادة للأرانب الأجسام المضادة الثانوية في 500 ميكرولتر من PBST للحصول على حل كوكتيل الأجسام المضادة الثانوية العاملة.
احتضان العينات مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. decant الحل وغسل العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق لكل غسل. إضافة 20 ميكرولتر من DAPI إلى عينات للتلطيخ النووي، واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ضعي زلة غطاء على الشريحة واغلقيها بطلاء الأظافر لمنع التجفيف والحركة. صورة العينات تحت المجهر الفلوري وتحديد إشارة الفلورسنت لمنطقة القلب باستخدام برنامج ImageJ. حساب التغييرات النسبية باستخدام متوسط نماذج التحكم DMSO وتحديد الأهمية الإحصائية للبيانات.
تم تقييم الأجنة المعرضة لPM 2.5 في غياب أو وجود مضادات الأكسدة، N-أسيتيل-L-السيستين، أو NAC، لوجود تشوهات في القلب. EOM من PM 2.5 تكلف زيادة كبيرة في تكوين المسخيات القلبية، مثل وذمة التامور، وتغيير الحلقات وانخفاض الحجم، مقارنة مع قلوب المعالجة DMSO السيطرة. كما انخفض معدل ضربات القلب بشكل كبير في الأجنة المعرضة ل EOM.
إضافة NAC مخففة عيوب القلب الناجمة عن EOM. تم استخدام فحص الفلورة المناعية لتقييم مدى تلف الحمض النووي في الأنسجة المعالجة بالحمض النووي EOM. تم زيادة مستويات التعبير 8-hydroxydeoxyguanosine و gamma-H2AX بشكل كبير في قلوب أجنة حمار وحشي تعامل مع EOM، مما يشير إلى زيادة في تلف الحمض النووي التأكسدي وفواصل حبلا مزدوجة الحمض النووي، على التوالي.
تم التصدي جزئيا للضرر الحمض النووي الناجم عن EOM عن طريق مكملات NAC. عند محاولة هذا البروتوكول، يجب الحرص عند غسل العينات باستخدام برنامج تلفزيوني، لأن قلب الحمار الوحشي قد يقشر الشريحة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يستخدم هذا البروتوكول مقايسة الفلورة المناعية للكشف عن تلف DNA الناجم عن الجسيمات الدقيقة PM 2.5 في القلوب المستأصلة من أجنة أسماك الزيبرا. تتيح هذه الطريقة الكشف الدقيق عن تعبير البروتين المستهدف في قلب سمكة الزيبرا.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء النمائي
- علم السموم
خلفية علمية
- يعتبر التألق المناعي تقنية قوية لتصور التعبير البروتيني.
- تعد أجنة سمك الزيبرا نموذجاً قيماً لدراسة العمليات التنموية.
- من المعروف أن التعرض لـ PM 2.5 يسبب مشكلات صحية متنوعة، بما في ذلك تلف DNA.
- إن فهم آثار السموم البيئية على النمو أمر بالغ الأهمية للصحة العامة.
الغرض من الدراسة
- لتقييم تأثير PM 2.5 على سلامة DNA في قلوب أسماك الزيبرا.
- لاستخدام التألق المناعي للكشف عن التغيرات في التعبير البروتيني.
- لإرساء طريقة موثوقة لتقييم تشوهات القلب في أجنة أسماك الزيبرا.
الطرق المستخدمة
- جمع ومعالجة أجنة سمك الزيبرا.
- مقايسة التألق المناعي للكشف عن البروتينات المستهدفة.
- فحص الأجنة تحت مجهر ستيريو بعد 72 ساعة من الإخصاب.
- التحليل الإحصائي باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (one way ANOVA) واختبار توركي للمقارنات المتعددة.
النتائج الرئيسية
- الكشف عن تلف DNA في قلوب أسماك الزيبرا الناتج عن التعرض لـ PM 2.5.
- تحديد التشوهات القلبية مثل الوذمة التأمورية وتغير الالتواء.
- قياس معدلات التشوه عبر مجموعات المعالجة المختلفة.
- تأكيد الدلالة الإحصائية للنتائج من خلال التحليل.
الاستنتاجات
- يؤدي التعرض لـ PM 2.5 إلى تلف كبير في الحمض النووي DNA في قلوب أسماك الزيبرا.
- تعتبر مقايسة التألق المناعي فعالة لدراسة التغيرات في التعبير البروتيني.
- يمكن استخدام هذا النموذج لإجراء المزيد من الأبحاث حول السموم البيئية وعلم الأحياء التنموي.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح بروتوكول التألق المناعي هذا تقليل المخاطر الميكانيكية للمواد السامة البيئية من خلال قياس المؤشرات الحيوية لتلف DNA في قلوب أجنة أسماك الزيبرا، والتي تُعد نموذجاً تنبؤياً للسمية القلبية التنموية. يدعم هذا المقايسة سير عمل التحقق من الهدف والمسح المظهري عن طريق ربط التعرض لـ PM2.5 بالإجهاد التأكسدي ومسارات كسر شريطي DNA المزدوج. كما يوفر بيانات عن مؤشرات حيوية انتقالية لتقييم المخاطر في مراحل الاكتشاف المبكرة، مما يساعد في عملية فرز المحافظ الخاصة بالمكتبات الكيميائية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من صحة الهدف
- القيمة العلمية: استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال الكشف عن 8-OHdG و γH2AX كمؤشرات ميكانيكية للتلف التأكسدي في الحمض النووي والكسور مزدوجة السلسلة.
- القيمة التشغيلية: تمكين الحد من المخاطر البيولوجية من خلال قراءات التألق المناعي الكمية التي توضح تنشيط المسار في أنسجة القلب.
- القيمة التنبؤية: دعم الثقة في الهدف من خلال ربط التغيرات في المؤشرات الحيوية الناجمة عن PM2.5 مع الأنماط الظاهرية لتشوه القلب.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: تجهيز أنسجة قلب سمكة الزيبرا المعتمدة لعمليات الفحص اللاحقة للمركبات السامة جينيًا باستخدام الكشف عن التعبير البروتيني القائم على التألق المناعي.
- القيمة التشغيلية: تقديم مخرجات كمية معيارية وقابلة للتكرار من خلال تحليل إشارات التألق في القلوب المستأصلة باستخدام برنامج ImageJ.
- قيمة القابلية للتوسع: تمكين إعادة استخدام المنصة لتقييم التغيرات في التعبير البروتيني الناجمة عن المواد الكيميائية البيئية في نظام مرتبط بالمرض.
الأبحاث الانتقالية والقبل سريرية
- القيمة العلمية: يوضح الصلة بالمرض من خلال الكشف عن تلف DNA في قلوب أجنة سمك الزيبرا، وهو نموذج يتميز بمسارات نمو قلبي محفوظة.
- القيمة التشغيلية: يضمن الاستمرارية الانتقالية من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى التحقق قبل السريري من خلال تقديم رؤية ميكانيكية حول السمية القلبية الناجمة عن PM2.5.
- التقدم المعدل حسب المخاطر: يوجه قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال قياس تخفيف تلف DNA عبر العلاج المشترك بمضادات الأكسدة (على سبيل المثال NAC).
تكامل مسارات العمل والتدفقات التشغيلية
تندرج هذه الطريقة ضمن تسلسل عملية الاكتشاف، بدءاً من التحقق من الهدف وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة، مما يوفر قراءات ميكانيكية تعزز الثقة التنبؤية في حملات الفحص في مراحلها المبكرة.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات من خلال قياس المؤشرات الحيوية لتلف DNA استجابةً للتعرض للمواد السامة البيئية.
- الفحص: يوفر جاهزية المقايسة ومخرجات كمية من خلال صبغ التألق المناعي الموحد وقياس التألق الكمي باستخدام برنامج ImageJ في قلوب أسماك الزيبرفيش.
- التحليلات: يُنتج مخرجات إحصائية (مثل تغيرات التألق النسبية، والدلالة المشتقة من ANOVA) التي تتيح المقارنة بين الحالات المختلفة والتحقق من النتائج الإيجابية.
- الأبحاث الانتقالية: يربط الاستمرارية قبل السريرية باستخدام نموذج أسماك الزيبرفيش الذي يمتلك مسارات نمائية ذات صلة بتقييم السمية القلبية البشرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس قدرة قابلة لإعادة الاستخدام لفحص مكتبات كيميائية متنوعة لتحديد إمكانية السمية الجينية في نموذج قلب فقاري.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: توفر ثقة تنبؤية من خلال الحد من المخاطر الميكانيكية لمسارات تلف DNA في فحص السمية التنموية.
- القيمة التشغيلية: تضمن التوحيد القياسي وقابلية التكرار عبر بروتوكولات ثابتة للتشريح والصبغ والتصوير باستخدام الحواجز الكارهة للماء والمجهر الفلوري.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال ربط التغيرات في المؤشرات الحيوية بالنتائج المظهرية، مما يقلل من المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة من برامج علم السموم.
- التأثير على المحفظة: تتيح تحديد الأولويات للمركبات بناءً على تعديل المخاطر وفقاً لإمكانية تلف DNA في نموذج قلب نامٍ.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التعامل مع أجنة zebrafish، وتشريح القلب، وتقنيات التألق المناعي.
- يعتمد على مجهر التألق وبرنامج ImageJ لتقدير كمية الإشارة والتحليل الإحصائي.
- يستلزم توحيد المعايير بين الفرق فيما يخص توقيت التشريح، وفترة تحضين الأجسام المضادة، وإجراءات الغسيل لمنع فقدان الأنسجة.
- يتضمن اعتبارات التكييف عند توسيع نطاق المقايسة لتشمل أنسجة zebrafish أخرى أو نماذج مرضية مختلفة.
- يتضمن قيوداً عملية مثل انفصال أنسجة القلب أثناء الغسيل، مما يتطلب تعاملاً دقيقاً مع PBS كما هو موضح في المادة المصدر.
