تصوير الخلايا الحية للصفائف أحادية الخلية (LISCA) - تقنية متعددة الاستخدامات لقياس الحركية الخلوية

التصوير بالخلايا الحية للصفائف أحادية الخلية تسمى LISCA هي أيضا قراءات تلقائية للدورات الزمنية الفلورية لمئات الخلايا الفردية. وميزة هذا النهج هي تسجيل استجابات الخلايا الفردية من خلايا معزولة مكانيا في بيئات دقيقة متطابقة، مما يسمح بإجراء تحليل فعال للانبعاثات مع إحصاءات كبيرة. لتصنيع صفيف خلية واحدة، استخدم مشرط لقطع تحفة PDMs واحدة تحتوي على ستة خطوط مسحوق صغير من طبقة PDMs، ووضع تحفة على مقاعد البدلاء المختبر مع نمط الصغرى التي تواجه ما يصل.

استخدم شفرة حلاقة لقطع كل من خطوط micropattern الستة إلى طابع PDMs ، مما يقطع بعض المناطق المنقوشة لضمان فتح حواف الطابع. بعد ذلك ، اخدش بعناية احباط واقية من زلة غطاء من شريحة ست غرف للاحتفال مواقف القناة من الشريحة ووضع زلة الغطاء على مقاعد البدلاء مع احباط واقية تواجه أسفل. استخدم الملاقط لوضع الطوابع على غطاء زلة في مواقف القناة ملحوظ، مع أنماط صغيرة تواجه أسفل، والتحقق من مرفق الطوابع تحت المجهر.

سوف تظهر المربعات في اتصال مع الشريحة أغمق من المسافات المشتركة. يتم تقليل جودة النقش بواسطة المربعات التي لم يتم إرفاقها بشكل صحيح بالشريحة. إذا كانت الطوابع قد تعلق بشكل آمن علاج زلة الغطاء والطوابع مع البلازما الأكسجين في 0.2 ملليبار من الضغط وحوالي 40 واط لمدة ثلاث دقائق لجعل السطوح بين الطوابع PDMs والغطاء زلة هيدروفيليك.

في نهاية تنظيف البلازما ، ضع الغطاء ينزلق إلى خزانة السلامة الحيوية وأضف 15 ميكرولتر من محلول البولي ل ليسين pegylated إلى كل طابع بحيث يتم امتصاص المحلول في النمط المائي للطابع. بعد 20 دقيقة، شطف الطوابع مع ملليلتر واحد من المياه فائقة النبع. استخدام ملاقط لإزالة الطوابع من الشريحة وشطف الغطاء زلة مرة ثانية مع ملليلتر الثاني من المياه فائقة النبع.

عندما يجف الغطاء تماما، نعلق على ست قنوات شريحة لزجة إلى زلة غطاء مع الحرص على أن المناطق الصغيرة منقوشة محاذاة مع الجزء السفلي من القنوات. وإضافة 40 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني و 40 ميكرولتر من محلول فيبروكتين لكل قناة. لخلط الحلين، قم بإزالة 40 ميكرولتر من خزان واحد وإضافته إلى الخزان المقابل لنفس القناة ثلاث مرات لتوليد حل متجانس.

عندما تكون جميع القنوات مختلطة، احتضن الشريحة لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل غسل كل قناة ثلاث مرات مع 120 ميكرولتر من PBS لكل غسل. تبادل برنامج تلفزيوني إلى 37 درجة مئوية، تكمل تماما وسيلة نمو الخلية في القنوات بإضافة 120 ميكرولتر المتوسطة إلى خزان واحد وإزالته من الخزان المقابل. إضافة 40 ميكرولتر من 400, 000 الخلايا لكل ملليلتر تعليق الخلايا من الفائدة و 40 ميكرولتر من الخلايا المتوسطة النمو إلى كل قناة, وخلط حل الخلية مع المتوسطة كما هو موضح.

بعد الاختلاط، قم بإزالة 40 ميكرولتر من التعليق من كل قناة بحيث تمتلئ القنوات فقط بتعليق الخلية، ووضع الشريحة في حاضنة ثقافة الخلية. بعد ساعة واحدة، تحقق من التصاق الخلية عن طريق المجهر النقيض المرحلة، وإضافة 120 ميكرولتر من 37 درجة مئوية متوسط نمو الخلية إلى كل قناة، ثم العودة الشريحة إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة ثلاث ساعات أخرى. لإعداد نظام التشوه، قم بتوصيل حقنة ملليلتر واحدة مليئة ب 37 درجة مئوية متوسط نمو الخلية إلى أنبوب مدخل النظام، واستخدم الصمام لملء الأنبوب بالوسط.

قم بتوصيل أنبوب المدخل بخزان قناة واحدة، مع الحرص على عدم محاصرة فقاعات الهواء، وتوصيل موصل تسلسلي بالمخزان المقابل للأنبوب المدخل للقناة الحالية. قم بتوصيل بقية القنوات كما هو موضح حتى يتم توصيل العدد المطلوب من القنوات في السلسلة. وتوصيل أنبوب منفذ مباشرة إلى خزان الحرة للقناة النهائية.

ثم ملء أنبوب متصل مع المتوسطة للتأكد من أن نظام التسريب لا تسرب. لتصوير الفاصل الزمني للخلايا، لإعداد بروتوكول الفاصل الزمني لتسجيل صورة النقيض من المرحلة وصورة مضان، تعيين التكوين البصري للتصوير النقيض من المرحلة والتصوير الفلوري. استخدم هدف 10 مرات، والمرشحات الفلورية المناسبة ونظام تصحيح التركيز الآلي لضمان جودة صورة أفضل للقياسات طويلة الأجل.

حدد 10 مللي ثانية وقت التعرض للتصوير النقيض المرحلة و750 مللي ثانية التعرض الوقت لتسجيل كثافة مضان EGFP. تعيين جدول زمني مع فاصل زمني مدته 10 دقائق بين الحلقات المتتالية من خلال قائمة الموضع ووقت مراقبة 30 ساعة. بعد ذلك ، ضع القنوات الست تنزلق على القبو الواحد في حامل العينة لغرفة التدفئة 37 درجة مئوية من المجهر وسجل أنابيب نظام التشوه إلى المسرح.

أدخل النهايات الحرة لأنابيب المأخذ في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر لجمع النفايات السائلة. وتعيين قائمة الموضع لقياس الفاصل الزمني المسح الضوئي، مع الحرص على أن عدد المواقف سوف تكون قادرة على أن يتم مسحها ضوئيا ضمن الفاصل الزمني المحدد بين حلقات متتالية من خلال قائمة الموقف. ثم ابدأ قياس الفاصل الزمني.

لإصابة الخلايا مع علامة الفلورسنت، استخدم حقنة لطرد نظام الأنابيب مع ملليلتر واحد من 37 درجة مئوية PBS، مع الحرص على أن مرحلة المجهر لا تتحرك. بعد التنظيف، وملء النظام مع 300 ميكرولتر من المصل خفضت المتوسطة تكملها ميرنا من الفائدة، إلى تركيز نهائي من 0.5 نانوغرام من مرنا لكل ميكرولتر، والسماح للe lipoplexes لاحتضان لمدة ساعة واحدة. في نهاية الحضانة، قم بتدفق النظام بميليلتر واحد من 37 درجة مئوية كاملة من متوسط نمو الخلية لإزالة أي مرنا غير منضم.

في نهاية التحليل، شاهد القنوات المدرجة في قائمة القناة ومرر عبر الأطر الزمنية لفحص تلك الخلايا المحددة مسبقا وإشارات الفلورسنت المتكاملة الخاصة بها. انقر على خلية ذات أهمية لتسليط الضوء على مسارها الزمني الفلوري ، أو انقر على مسار زمني للعثور على الخلية المقابلة. اضغط على shift أثناء النقر على خلية لتحديدها أو إلغاء تحديدها.

إلغاء تحديد أي خلايا غير قابلة للحياة أو غير محصورة في بقعة التصاق أو المرفقة بخلية أخرى لاستبعادها من مزيد من التحليل. عند تحديد كافة الخلايا أو إلغاء تحديدها بشكل مناسب، احفظ دورات وقت الخلية الواحدة لمنطقة الخلية والفلورسينس المدمج في دليل مناسب. لتحديد وقت بدء الترجمة بعد التحويل ، وقوة تعبير EGFP الخلوي ، يمكن استخدام نموذج ترجمة من ثلاث مراحل.

يمكن تركيب الحل النموذجي ل EGFP لدورات وقت الخلية الواحدة كما هو موضح. هنا، يمكن ملاحظة المدرجات التكرارية لوقت بدء الترجمة ومعدل التعبير عن الخلايا المتحولة إلى المخ. كما يتم تقدير كل المعلمات لكل خلية، يمكن تحليل ارتباط هذه المعلمات كما هو موضح في مؤامرة مبعثر، ومقارنتها مع الخلايا المصابة بالجسيمات النانوية الدهنية.

كما هو موضح، تظهر الخلايا المصابة بالجسيمات النانوية الدهنية تباينا أقل من خلية إلى خلية مقارنة بالخلايا المصابة بالليبوبلس. ويظهر متوسط عدد السكان بداية أسرع للترجمة، فضلا عن ارتفاع معدل التعبير. ويمكن أيضا تكييف نهجنا مع أساليب بديلة للأنماط الدقيقة.

الأكثر أهمية بالنسبة لل LISCA هو حبس زنزانة جيدة ومزيج من تحليل الصورة الآلي مع إشراف المستخدم مريحة. كما رأيتم، سلوك الخلية غير متجانس. وتوفر أفلام الفاصل الزمني ذات الخلية الواحدة إمكانية الوصول إلى ديناميكيات غير متحيزة للشبكات الكيميائية الحيوية المتأصلة.

على سبيل المثال، في التعبير الأخضر، apoptosis أو الخلايا قتل المقايسات.