المجهر الإلكتروني المتسلسل لمسح الوجه الكتلي (SBF-SEM) لعينات الأنسجة البيولوجية

يوفر المجهر الإلكتروني المتسلسل لمسح الوجه الكتلي رؤية غير مسبوقة للهياكل فائقة الأنسجة ثلاثية الأبعاد ، ويمكن الإجابة على مجموعة من الأسئلة التي كانت مستحيلة في السابق أو صعبة للغاية. تسمح هذه التقنية بالإنتاج السريع والتكرار لمجموعات البيانات ثلاثية الأبعاد مع الحد الأدنى من شحن الأنسجة والتحف. والأهم من ذلك ، فإنه يسمح بالتقاط تلقائي لآلاف الصور يوميا.

يوفر المجهر الإلكتروني القياسي للإرسال بنية فائقة خلوية ممتازة. ومع ذلك، تفتقر هذه الصور إلى سياق ثلاثي الأبعاد، وقد يكون من الصعب تفسيرها. المتسلسل كتلة الوجه المسح المجهري الإلكتروني يوفر هذا السياق ثلاثي الأبعاد، مما يسمح لتفسير العمليات المعقدة.

وفي حين أن هذا البروتوكول موثوق وقابل للاستنساخ، فإن بعض الخطوات تتطلب الدقة وهي ذات أهمية حاسمة لنجاح هذه المنهجية. سيوضح هذا الفيديو هذه الخطوات الهامة بالتفصيل. بعد تحديد عينات في 0.1 صوديوم الأضراس cacodylate العازلة، التي تحتوي على 2.5٪ غلوتارالدهيد، واثنين من كلوريد الكالسيوم ملليمولار، وينبغي قطع العينات إلى كتل لا يزيد حجمها عن ملليمترين مكعبات، وغسلها مع 0.1 الصبار الصوديوم الضرس العازلة التي تحتوي على اثنين من كلوريد الكالسيوم ملليمولار.

ثم يتم تلطخ الأنسجة بالتتابع مع فيروكيانيد أوسميوم، ثيوكاربوهيدرازايد، وتيتروكسيد أوسميوم. بعد حضانة أكسيد الأوسميوم، عالج الأنسجة بخلات أورانيل مائي بنسبة 1٪ عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، حل 0.066 غرام من نترات الرصاص في 10 ملليلتر من محلول حمض الأسبارتيك الضرس 0.03، واستخدام واحد هيدروكسيد البوتاسيوم العادي لضبط درجة الحموضة من محلول الأسبارتات الرصاص والتون إلى 5.5.

بعد تسخين المحلول في الفرن ، اغسل الأنسجة خمس مرات لمدة ثلاث دقائق لكل غسل في درجة حرارة الغرفة ، والمياه المقطرة المزدوجة ، قبل نقل الأنسجة إلى درجة حرارة 60 درجة مئوية أدفأ محلول الأسبارتات الرصاصي ل والتون لمدة 30 دقيقة عند 60 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، اغسل الأنسجة وجففها في سلسلة أسيتون صاعدة باردة، تليها حضانة لمدة 10 دقائق في الأسيتون في درجة حرارة الغرفة. ثم ضع الأنسجة في نسبة 1:3 من الراتنج المختلط الصلب في الأسيتون لمدة أربع ساعات من التسلل على منصة دوارة ، تليها تسلل لمدة ثماني ساعات أو بين عشية وضحاها في نسبة 1:1 من الراتنج إلى محلول الأسيتون على منصة دوارة ، ثم تسلل بين عشية وضحاها في نسبة 3:1 من الراتنج إلى الأسيتون على المنصة الدوارة.

في صباح اليوم التالي، التسلل إلى الأنسجة في الراتنج الطازجة 100٪لمدة أربع إلى ثماني ساعات، واحدة بين عشية وضحاها، وتسلل واحد لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة على منصة الدورية. في صباح اليوم التالي، استخدم عصا خشبية لخلط كمية صغيرة من الراتنج مع مسحوق أسود الكربون حتى يتم تشبع الراتنج مع مسحوق، ولكن لا يزال السائل ولا تصبح محبب. يجب أن يشبه السكن الحبر السميك ، وأن يكون قادرا على التنقيط ببطء دون كتل مرئية ضع عينة الأنسجة في قالب مطاطي من السيليكون ، والتقاط صورة للرجوع إليها لاحقا من اتجاه العينة داخل كتلة الراتنج.

عندما تكون العينة في مكانها، قم بتغطية الأنسجة في الراتنج المشبع الأسود الكربوني في طرف قالب السيليكون، مع التسمية التي تشير إلى التفاصيل التجريبية والأنسجة في القالب في الطرف المقابل من الراتنج. ثم ضع القالب في فرن 65 درجة مئوية على منحدر لمدة ساعة تقريبا. عندما يكون الكربون الأسود المشبع الراتنج قد شفي بما فيه الكفاية، وإزالة القالب من الفرن، وبدءا من بئر فارغة، وملء ما تبقى من القالب مع الراتنج واضحة، مع الحرص على أن التسمية لا تزال مرئية.

عندما يتم تغطية العينة مع الراتنج واضحة، وضع قالب السيليكون مرة أخرى في فرن 65 درجة مئوية، وليس على المنحدر، لمدة 48 ساعة، ثم إزالة القالب. لإعداد كتلة للتصوير، ووضع العينة الراتنج جزءا لا يتجزأ على تشاك microtome مع نهاية مدبب الشائكة ما يقرب من خمسة إلى ستة ملليمترات من تشاك. قفل العينة في مكان مع المسمار مجموعة، ووضع العينة تحت مصباح الحرارة.

بعد عدة دقائق، ضع تشاك في حامل مجهر ستيريو، واستخدام جديد، شفرة حلاقة ذات حدين لجعل أقسام رقيقة موازية لوجه كتلة حتى الأنسجة مرئية، والتي سوف تكون أقل عاكسة وحبيبية بالمقارنة مع أجزاء من الراتنج التي تخلو من الأنسجة. تأمين دبوس عينة الألومنيوم في حامل دبوس التشذيب، وجعل العديد من الخدوش العميقة، متقاطعة في وجه دبوس لتوفير مساحة أكبر للغراء المستخدمة لعقد العينة في مكانها. ضع العينة تحت مصباح حراري ، وادفع شفرة الحلاقة من ملليمتر إلى ملليمترين مباشرة إلى أسفل في كتلة الراتنج قبل إجراء قطع ثاني عمودي من العمق المتساوي في الكتلة ، لتقليم الراتنج الزائد من عينة الأنسجة بحيث يبلغ قطر الكتلة حوالي ثلاثة ملليمترات من قبل اثنين إلى ثلاثة ملليمترات في الارتفاع.

بعد هذا التشذيب الأولي، قم بتسخين الكتلة تحت مصباح الحرارة مرة أخرى، واستخدم شفرة حلاقة جديدة ذات حدين لقطع الجزء العلوي من كتلة الراتنج ما يقرب من ملليمتر واحد تحت الجزء المشذب في قطع واحد ناعم. ضع حامل دبوس التشذيب ، الذي يحتوي على دبوس الألومنيوم المقطوع ، في وعاء المنظار المجسم ، وطبق طبقة رقيقة من الغراء السماوي على الوجه الدبوس بحيث يغطي الدبوس تماما دون تشكيل الغضروف المفصلي المرئي. استخدم ملقط للضغط على قطعة من كتلة الأنسجة قلصت على وسط الوجه دبوس عينة لعدة ثوان، والسماح للغراء لتعيين لعدة دقائق.

عندما يجف الغراء تماما، حدد موقع الأنسجة على الجزء الذي تم رفعه من كتلة الراتنج، واستخدام شفرة حلاقة ذات حدين لتقليم الجزء المرفوع من الراتنج الذي يحتوي على عينة الأنسجة إلى منطقة لا تزيد مساحتها عن ملليمتر مربع واحد. ببطء وبعناية، وإزالة أكبر قدر ممكن من الراتنج الزائد، وترك كتلة أطول قليلا في بعد واحد، واستخدام ملف معدني النهائي لزاوية الراتنج الزائد في المنطقة خارج الجزء الذي أثار يحتوي على عينة الأنسجة وصولا الى حافة دبوس. إزالة جزيئات الراتنج والغبار من العينة المعدة قبل تطبيق طبقة رقيقة من الطلاء الفضي والذهب البصق على سطح كتلة العينة بأكملها.

بعد الطلاء، وتقليم أي الطلاء الفضة الزائدة من أسطح الوجه كتلة، ووضع كتلة شنت وقلصت في نهاية لمبة من أنبوب ماصة نقل حسب الطلب مع التسمية المناسبة المرفقة. باستخدام التصوير SBF-SEM، تم تحديد شبكة من حزم الألياف الدقيقة الخالية من الإيلاستين داخل قرنية الفئران البالغة. يتم تنظيم هذه الشبكة في طبقات متميزة ، مع الألياف المرتبطة ارتباطا وثيقا مع الخلايا القرنية ، حتى ملقاة داخل التشنج الضحلة على سطح القرنية.

وقد أدى تطبيق هذا البروتوكول إلى اكتشاف مجموعة غير معروفة من الأعصاب القرنية المركزية التي تنصهر مع الخلايا الظهارية القاعدية على الحدود الظهارية السترومال. يكشف تصوير SBF-SEM للقرنية المركزية عن وجود الأوعية الدموية الحوفية ، وحزم الأعصاب ، والخلايا المرتبطة بها التي يمكن تقسيمها يدويا لإعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد. تتضمن بعض المزالق في إجراء التصوير هذا استخدام وقت سكن بكسل طويل جدا ، والذي يمكن أن يسبب صورا لاحقة متموجة ومشوهة ، وتفريغات صغيرة من الإلكترونات من وجه الكتلة ، مما يؤدي إلى تغييرات سريعة في التباين في الخطوط أو خدوش سكين على وجه الكتلة بسبب سكين معطوب أو تراكم الحطام على حافة السكين ، والتحف من شعاع الإلكترون الموسعة التركيز على وجه كتلة في حين أن العينة لا تزال في غرفة التصوير، تثبيت الأنسجة غير لائق، مما يؤدي إلى فصل الهياكل الخلوية والأنسجة الضامة، وتخطي الصورة نتيجة لكمية كبيرة من الشحن داخل كتلة الأنسجة أو الراتنج.

عند قطع كتلة الأنسجة، من المهم أن يكون لديك فهم جيد للمكان الذي تقع فيه الأنسجة داخل الكتلة، وذلك لعدم تقليم بطريق الخطأ بعيدا أي مناطق عينة هامة. إذا رغبت في صور عالية الدقة لهياكل أو تفاعلات خلوية محددة ، يمكن إيقاف التصوير ، وإزالة الكتلة من المجهر ، وقطع المقاطع على بروتين فائق حيث يمكن مشاهدتها في المجهر الإلكتروني الإرسال المسلسل كتلة الوجه المسح المجهري الإلكتروني يسمح رؤية فريدة تماما من الأنسجة البيولوجية. باستخدام هذا البروتوكول، تمكنا من الحصول بسرعة على مجموعات بيانات عالية الجودة، وتوسيع نطاق الأنسجة التي يمكننا استكشافها.