توصيف رواية الإنسان Organotypic تقنية ثقافة الشبكية

تحافظ هذه التقنية على جميع طبقات الشبكية وأنواع الخلايا في الموقع، مما يجعلها أكثر ملاءمة سريريا مقارنة بالنماذج الحيوانية وفي المختبر. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هو أنه يقلل من اضطراب سلامة الشبكية أثناء التعامل مع الأنسجة، وهو أمر ضروري عند مقارنة الشبكية الصحية والممرضة. يمكن محاكاة أمراض الشبكية عن طريق زراعة الأنسجة في ظروف محددة.

وهذا يسمح لاختبار العلاجات الدوائية الجديدة. إجراءات التشريح وجمع العينات معقدة. لذلك، العرض التوضيحي المرئي أمر بالغ الأهمية لمساعدة القراء على فهم البروتوكول المكتوب وإجراء الإجراء بنجاح.

إثبات الإجراء سيكون شاريس كو، طالبة دكتوراه في السنة الثانية من مختبري. إعداد المتوسطة الثقافة التي تحتوي على دولبيكو تعديل النسر المتوسطة / خليط المغذيات F-12 ومرة واحدة المضادات الحيوية وخليط مضادات المخدرات. أولا، ضع 500 ميكرولتر من المتوسط في لوحة من 24 بئرا وتوازنها في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون.

وجود وسائل الإعلام جاهزة قبل استخراج explant يتجنب إزاحة شبكية العين عند إضافة لاحقة. لاستخراج النباتات الشبكية، تبدأ بوضع فنجان العين على طبق بيتري مع القزحية والعدسة التي تواجه صعودا و ONH الاتصال طبق بيتري. عقد eyecup ثابتة في طي النسيان باستخدام ملقط وفصل القزحية والعدسة عن طريق جعل تخفيضات صغيرة محيط على طول الحافة الخارجية للأطراف.

إزالة القزحية والعدسة بعناية، مع التأكد من تجنب إزعاج شبكية العين. تحديد ONH باستخدام مصدر الضوء الأبيض الساطع وincise في الأرباع الأربعة نحو ONH تناوب طبق بيتري لتسهيل التعامل معها. انتشار وتسطيح eyecup بعناية.

تطبيق ملقط على تصلب بدلا من شبكية العين لتجنب تعطيل سلامة الشبكية. إزالة اللوحة التي تحتوي على الوسائط المعدة من الحاضنة. ضع تريفين جراحي على شبكية العين في منطقة بدون طيات شبكية العين واضغط بقوة لاختراق الصلبة ، والتي يجب أن تولد صوتا تكسيرا أثناء اختراق طبق بيتري.

تدوير التريفين لضمان اختراق الصلبة بالكامل بحيث يتم فصل explant الشبكية الآن من بقية العينة. تطبيق ملقط في تصلب ونقل explant الشبكية شطيرة إلى وسط الثقافة. زراعة النباتات الشبكية شطيرة جمعها في 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 72 ساعة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ مرطب.

وأظهرت تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوسين أن النباتات الخارجية الشبكية ساندويتش الحفاظ على سلامة وهيكل lamellae متميزة من GCL إلى ONL مع نواة مدمجة في الطبقات النووية الداخلية والخارجية. تم العثور على سلامة الشبكية المعطلة على حواف العينة نفسها حيث انفصلت شبكية العين عن المشيمية والصلابة الكامنة وراء RPE والتي تظهر انخفاض سمك الشبكية وفقدان النواة في INL و ONL. لم يتم العثور على نواة الخلايا الإيجابية TUNEL ، التي تميز موت الخلايا المبرمج الخلوي ، في النباتات الشبكية المستزرعة في ظروف القاعدية ، مما يدل على حيوية خلوية مستدامة حتى بعد 72 ساعة.

تم تقييد وضع العلامات GFAP إلى GCL وIPL دون التليف الدبقية ، وهي علامة على علم الأمراض التي سيتم تحديدها كتعبير موسع عن GFAP في ONL. تم التعبير عن فيمينتين للغاية من طبقة خلايا العقدة إلى الطبقة النووية الخارجية ، مما يدل على سلامة خلايا مولر المحفوظة كما رأينا في أنسجة الشبكية العادية. أظهر الفحص المغناطيسي Luminex أن مستويات IL-18 و VEGF و IL-6 و IL-8 زادت بشكل كبير فوق خط الأساس في ثقافات explant الشبكية في الجلوكوز العالي والسيتوكينات المؤيدة للالتهابات بعد 24 ساعة.

بعد 72 ساعة، ظلت مستويات IL-18 و VEGF زيادة كبيرة، ولكن لم يتم العثور على فرق كبير في مستويات IL-6 و IL-8. عند تنفيذ هذا الإجراء، وترك ما يكفي من الزجاجي المتبقية، والتي سوف تزن شبكية العين إلى أسفل بحيث لا تنفصل عن المشيمي RP وتطفو في وسائل الإعلام الثقافة. يمكن زيادة توصيف شبكية العين المثقفة باستخدام الكيمياء المناعية والأنسجة ، في حين يمكن قياس السيتوكينات الالتهابية التي يتم إطلاقها في الوسط المستزرع باستخدام المقايسة المغناطيسية Luminex.

هذا النموذج هو أكثر قابلية للترجمة سريريا بالمقارنة مع نماذج الحيوان وفي المختبر، مما يجعل أكثر ملاءمة لاختبار فعالية الأدوية العلاجية الجديدة لأمراض الشبكية.