تسجيل التيارات الكهربائية عبر غشاء البلازما لخلايا المنوية من الثدييات

كان تسجيل النشاط الكهربائي لخلية الحيوانات المنوية باستخدام تقنية الرقعة المثبتة دورا أساسيا في تحديد قنوات أيونات الحيوانات المنوية المختلفة وفهم كهربية الحيوانات المنوية على المستوى الجزيئي. تتفوق هذه الطريقة في قياس البصمات الكهربائية الفسيولوجية والدوائية لقنوات الأيونات، وهي الأداة الأكثر موثوقية لتحديد قنوات الأيونات. نظرا للأهمية الفسيولوجية لقنوات الأيونات والناقلات الكهروجينية لخصوبة الذكور، تعد هذه التقنية أداة قوية لفهم بعض عيوب الحيوانات المنوية التي تؤدي إلى العقم.

لتصنيع الميكروبايبت، ابدأ بشعيرات زجاجية بوروسيليكات بقطر خارجي 1.5 مليمتر، وقطر داخلي 0.86 مليمتر، وخيط داخلي. تأكد من أن قطر رأس الماصة الداخلي حوالي ميكرومترين قبل التلميع على الحريق، ويتم تقليله إلى 0.5 ميكرومتر بعد التلميع الصحيح. قم بتجميع جسر أجار للحفاظ على البيئة حول القطب المرجعي مستقرة.

اصنع شعيرات زجاجية على شكل حرف L عن طريق ثنيها تحت نار صغيرة من نوع بنسن واتركها تبرد. اصنع محلول من 1٪ أجاروز في كلوريد بوتاسيوم ضرس واحد وسخنه في ميكروويف حتى يذوب الأجاروز ويصبح المحلول شفافا. املأ الشعيرة الزجاجية على شكل حرف L بالأغاروز بعناية لتجنب فقاعات الهواء واتركها تبرد إلى درجة حرارة الغرفة.

بدلا من ذلك، غمر الشعيرة الزجاجية على شكل حرف L في الأجاروز المذاب. حرك الوعاء عدة مرات وسخنه مرة أخرى في الميكروويف حتى يغلي الأغاروز، مما سيطرد فقاعات الهواء من جسر الأجار. افتح منطقة أسفل بطن الفأر بالمقص واستخرج كلا البربخين.

ضعها في طبق زراعة خلايا بحجم 35 ملم مملوء بمحلول ملحي عالي أو محلول HS تم تسخينها مسبقا إلى درجة حرارة الغرفة. انقل البريديميدات إلى طبق جديد لزراعة الخلايا يحتوي على محلول HS وأزل جميع الدهون المتبقية تماما. افصل البربخ إلى كابوت، كوربوس، وكودا باستخدام شفرة مشرط رقم 15.

انقل جسم كل بربخ إلى طبق جديد لزراعة الخلايا يحتوي على محلول HS. قم بعمل عدة شقوق في الجزء المعزول من البربخ باستخدام شفرة مشرط مدببة رقم 11. انقل أجزاء الإبيديميدات ذات الشقوق المتعددة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 ملليلتر يحتوي على 1.5 ملليلتر من محلول HS.

اهز خلايا الحيوانات المنوية لفترة وجيزة من البربخ إلى المحلول باستخدام ملقط دومونت من النوع 5A فائق النحية. ثم تخلص من البربخيات واترك الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. انتظر حتى تتراسب المادة الصلبة إلى قاع الأنبوب.

ثم نقل المادة الفائقة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق آخر بسعة 1.5 ملليلتر. ابحث عن الخلية المنوية المناسبة التي تحتوي على قطرة سيتوبلازمية باستخدام تكبير 600x. تأكد من أن القطرة السيتوبلازمية بيضاوية الشكل ولها شكل مغزل طويل قليلا.

اختر حيوان منوي متحرك مع رأس متصل بغطاء الغطاء بحيث تكون الخلية المنوية ثابتة جزئيا، لكن القطرة السيتوبلازمية وبقية السوط تستمر في الحركة مع ضرب الأساط. تأكد من أن رأس الحيوانات المنوية مثبت بشكل فضفاض على غطاء الغطاء. بعد الاختيار البصري لخلية الحيوانات المنوية ذات شكل مناسب، يمكنك ملء الميكروبايبت بمحلول الماصة وتثبيتها في حامل الماصة.

للحفاظ على نظافة رأس الماصة من الحطام، اضغط الضغط الإيجابي على الماصة باستخدام مجموعة على شكل أنبوب U. اخفض الماصة واغمس طرفها في محلول الحمام. لرؤية الخلية بوضوح، ضع طرف الماصة فوق القطرة السيتوبلازمية بحيث يكون فتحة الرأس محاذية قطريا نحو القطرة.

اخفض بسرعة طرف الماصة نحو القطرة حتى يكونا في نفس المستوى البؤري. بمجرد أن يلامس طرف الماصة القطرة، اضغط ضغطا سالبا على الماصة لتحريك جزء من القطرة إلى الطرف وتكوين ختم جيجا-أوم. ثم ارفع الحيوان المنوي من غطاء الدرج.

تعويض الانتقال العشوائي للسعة باستخدام وضع التعويض في المضخم قبل الانتقال إلى وضع الخلية الكاملة. قم بتنفيذ عملية كسر وانتقال إلى وضع الخلية بالكامل بتطبيق مللي ثانية واحدة مع زيادة تدريجية لنبضات الجهد مع شفط خفيف جدا. بعد تطبيق كل نبضة جهد كسر، أطلق أداة اختبار الغشاء للتحقق مما إذا كان يظهر انتقال سعة أكبر.

تكييف السعة الأكبر لتحديد سعة الخلية بأكملها، بالإضافة إلى مقاومة الوصول لها. بعد اختراق ناجح، تابع تجارب تثبيت القطع بالكامل مثل تطبيق محاليل حمامات تحتوي على مركبات مختلفة أو قياس أنشطة القناة باستخدام بروتوكولات خطوة الجهد أو بروتوكولات منحدر الجهد. تم إجراء تسجيلات CatSper عن طريق إنشاء ختم عالي المقاومة بين الماصة الرقعة وحيوان الحيوانات المنوية الثديية عند قطرتها السيتوبلازمية.

تم تسجيل كثافات تيار CatSper لخلايا السيزيوم الكاملة من خلايا الحيوانات المنوية من النوع البري الذيلي، وخلايا الحيوانات المنوية في الخلايا العصبية الذيلية التي تفتقر إلى CatSper. تختلف خلايا الحيوانات المنوية من الأنواع المختلفة في شكلها ومسارات تنظيمها الداخلية. أظهرت الحيوانات المنوية للالرئيسيات والإنسان خصائص وتنظيم قنوات CatSper متشابهة.

ومن المثير للاهتمام أن تنشيط البروجسترون في CatSper يبدو فريدا في حيوانات الحيوانات المنوية للالرئيسيات. لم تظهر الحيوانات المنوية للخنازير البرية أو الثور أو القوارض أي تغيير محفز بالبروجسترون في تيارات CatSper الخاصة بهم. في حيوانات الثور والخنازير المنوية، كان نشاط قناة CatSper القاعدي أقل من الحدود القابلة للكشف، مما يشير إلى أن تدفق الكالسيوم وفرط النشاط الناتج عنه مدفوعان بقنوات أو ناقلات أخرى أو أن هناك حاجة إلى محفز طبيعي مختلف لتنشيط قنوات CatSper الخاصة بهم.

القطرات السيتوبلازمية الصغيرة والناعمة والموحدة وغير المنتفخة بشكل مفرط هي الأنسب للعمل مع الرقعة المثبتة. يجب تجنب استخدام تلك القطرات السيتوبلازمية الصغيرة من جانب واحد ومنتفخة وشفافة تماما لأنها ستؤدي إلى ضعف أو عدم إحكام الختم. تمكن هذه التقنية من دراسة دقيقة لقنوات الهواء المحددة في نظام التعبير الطبيعي لها، ويعتمد النجاح على خلايا الحيوانات المنوية المتغيرة عالية الجودة، والمناطق النقية، والمهارات الفسيولوجية الفكرية الأساسية، والصبر، والأهم من ذلك، المثابرة.