ديسمبر 22, 2020
نحن نقدم بروتوكولا خطوة بخطوة لتلطيخ التألق المناعي الكامل للعقدة الجيبية الأذينية (SAN) والعقدة الأذينية البطينية (AVN) في قلوب الفئران.
يشرح هذا البروتوكول الخطوات اللازمة لإجراء التشريح الدقيق والتلوين المناعي الكامل والفحص المجهري خصيصا للعقدة الجيبية والعقدة الأذينية البطينية في الماوس. تعد منهجية التركيب الكاملة مفيدة لمعالجة التوطين ثلاثي الأبعاد الدقيق ومورفولوجيا الجيوب الأنفية والعقدة الأذينية والبصرية وفحص العلاقة مع الأنسجة المحيطة. يتم الحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة بشكل كبير مع الحد الأدنى من جفاف الأنسجة والتمزق الجسدي.
للبدء ، قم بثقب القلب بإبرة قياس 27 في منطقة القمة عن طريق دفع الإبرة بعناية إلى البطين الأيسر وحقن خمسة إلى 10 ملليلتر من PBS المثلج البارد برفق لإغزارة القلب. ارفع القلب بحذر باستخدام ملاقط واقطع الأوعية الكبيرة لإزالة القلب. ضع القلب في طبق تشريح مليء ب PBS المثلج تحت مجهر التشريح.
بعد تحديد اتجاه القلب ، أدر القلب بحيث يكون الجزء الأمامي من القلب في قاع الطبق. شل حركة القلب عن طريق وضع دبابيس صغيرة من خلال القمة والزائدة الأذينية في الاغاروز في الجزء السفلي من طبق التشريح. باستخدام ملاقط ومقصات دقيقة ، قم بإزالة الأنسجة غير القلبية بعناية حول الوريد الأجوف العلوي والسفلي.
لفضح المنطقة بين البطينين ، قم بإزالة غالبية البطينين عن طريق القطع بالتوازي مع الأخدود بين البطينين والأذينين بمقص صغير. للتثبيت والجفاف ، ضع العينة في 4٪ بارافورمالدهيد بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، انقل القلب إلى محلول سكروز 15٪ واحتضانه لمدة 24 ساعة عند أربع درجات مئوية.
بعد الحضانة ، انقل القلب إلى محلول سكروز بنسبة 30٪ لمدة 24 ساعة أخرى عند أربع درجات مئوية. اغسل القلب في 1٪ Triton X-100 مخفف في PBS. ثم قم بتثبيته واختراقه في محلول الحجب طوال الليل عند أربع درجات مئوية.
ضع القلب في أنبوب سعة 1.5 مليلتر واحتضنه باستخدام الأرانب المضادة للفأر Connexin 43 والأجسام المضادة HTN4 المضادة للفئران المخففة بمحلول مانع لمدة سبعة أيام عند أربع درجات مئوية. بعد سبعة أيام، قم بإزالة المحلول الذي يحتوي على الأجسام المضادة الأولية باستخدام ماصة. اغسل القلب بمحلول Triton X-100 1٪ ثلاث مرات لمدة ساعة واحدة لكل غسلة على الخلاط المداري.
كرر خطوات الغسيل بعد الحضانة بالأجسام المضادة الثانوية و DAPI. بعد تحضير الحلقات البلاستيكية وتعبئتها بالبلاستيسين ، ضع القلب في أخدود البلاستيسين بحيث يكون الجزء الخلفي من القلب متجها لأعلى. حدد SAN ، الذي يقع على الجانب الظهري من القلب مع المنطقة الفاصلة.
أضف PBS إلى القلب لإزاحة كل الهواء داخل التجويف حتى يتم تغطية القلب بالكامل ب PBS. ضع السيليكون على حواف الحلقة البلاستيكية. اضغط برفق على الجزء المحيط من العينة في البلاستيسين لتثبيت القلب وتغطية القلب بزلة غطاء.
ثم اضغط برفق على الجانب الخلفي من البلاستيسين للضغط على بعض PBS وإرفاق القلب بزلة الغطاء مع الحرص على تجنب أي فقاعات هواء داخل منطقة التصوير. ضع عينات التلوين الكاملة رأسا على عقب على منصة المجهر متحد البؤر واستمر في التصوير كما هو موضح في المخطوطة النصية. يتم تعيين المعلمات لكل قناة من المجهر متحد البؤر باستخدام البرنامج المعني.
تم استخدام هذا البروتوكول لإجراء التصوير المجهري متحد البؤر لكل من العقدة الجيبية الأذينية والعقدة الأذينية البطينية في قلوب الفئران. إن تلطيخ نظام التوصيل وعضلة القلب العاملة بالأجسام المضادة الفلورية ، والتي تستهدف HCN4 و Connexin 43 على التوالي ، تجعل من الممكن تحديد العقدة الجيبية الأذينية والعقدة الأذينية البطينية داخل التشريح السليم. يتيح بروتوكول التلوين الكامل هذا دراسة تفاعل أنواع الخلايا المختلفة باستخدام أجسام مضادة مختلفة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
يوضح هذا البروتوكول خطوات الصبغ المناعي الفلوري للعينة الكاملة للعقدة الجيبية الأذينية (SAN) والعقدة الأذينية البطينية (AVN) في قلوب الفئران. وتتيح هذه المنهجية التحديد الدقيق للموقع ثلاثي الأبعاد وفحص المورفولوجيا لهذه التراكيب القلبية.
يوفر التصوير ثلاثي الأبعاد عالي الدقة للعقدتين الجيبية الأذينية والأذينية البطينية في نماذج الفئران حلاً لفجوة حرجة في أبحاث الفيزيولوجيا الكهربائية للقلب، مما يتيح رسم خرائط تشريحية وخلوية دقيقة. وتعزز هذه القدرة من الثقة التنبؤية في التحقق من الأهداف في المراحل المبكرة لآليات عدم انتظام ضربات القلب، وتدعم الاستمرارية الانتقالية من مرحلة الاكتشاف إلى الدراسات القلبية قبل السريرية. كما أن الحفاظ على سلامة الأنسجة وتمكين تحليل أنواع الخلايا المتعددة يجعل من سير العمل هذا مورداً قابلاً لإعادة الاستخدام في محافظ البحث والتطوير الخاصة بالأمراض القلبية الوعائية.
يربط سير عمل التصوير المجهري البؤري والفلورة المناعية للعينة الكاملة بين مراحل الاكتشاف المبكر، والتحقق من الأهداف، والأبحاث القلبية قبل السريرية، وذلك من خلال توفير بيانات تشريحية كمية وعالية المحتوى.