اكتشاف المنظمين النقيلي باستخدام نموذج الغشاء السريع والكمي داخل الفرخ Chorioallantoic
فبراير 3, 2021
هذه طريقة فعالة لفحص المكثفات أو محركات الانبثاث السرطاني. يتم حقن الخلايا ، التي يتم تحويلها باستخدام مكتبة التعبير ، في الأوعية الدموية للغشاء المشيمي للدجاج لتشكيل مستعمرات منتشرة. يتم استئصال المستعمرات التي انخفضت أو زادت من الغازية ، وتوسيعها ، وإعادة حقنها لتأكيد النمط الظاهري ، وأخيرا ، تحليلها باستخدام تسلسل الإنتاجية العالية.
يسمح بروتوكولنا بتحديد فعال لتركيبات الجينات أو الجينات التي تمنع غزو السرطان في المشاهد. على الثقافة لا يتطلب متقدمة مرافق لصيانة. ككل ، يمكن فحص مكتبات عامة أو عامة خاصة في غضون عدة أسابيع في المشاهد.
وسيساعد هذا النظام على فحص الباحثين اكتشاف أهداف الجينات العلاجية الجديدة أو مجموعات الأهداف الجينية التي يمكن استخدامها لمنع الانبثاث السرطان. لحقن IV، ركز الخلايا إلى 0.5 إلى 1 مليون خلية لكل ملليلتر، باستخدام الجليد البارد 1X PBS لتخفيف أو إعادة تعليق الخلايا. نتوقع ما يقرب من ملليلتر واحد من تعليق الخلية ستكون هناك حاجة لكل 10 أجنة.
لتجميع جهاز الحقن، قم بتركيب إبرة على الحقنة، ثم قم بتمديد إبرة الحقن بقطعة أنابيب طولها من ثلاثة إلى خمسة سنتيمترات. كسر غيض من إبرة borosilicate باستخدام ملقط غرامة. تحميل المحاقن مع 50 إلى 200 ميكرولتر من تعليق الخلايا السرطانية.
وأدخل إبرة البوروسيليكات في الأنابيب. فحص الإبرة لانسداد الخلايا وفقاعات الهواء. إذا لوحظ انسداد الخلايا داخل الشعرية، قم بإزالة الشعرية، وإعادة تعليق الخلايا واستبدالها بشعيرات شعرية جديدة.
استخدام المكبس لدفع أي فقاعات. قم بإزالة غطاء الغطاء ونقل الجنين تحت المجسم. تحديد الوريد المناسب لحقنها على سطح CAM;الذي عادة ما يكون أوسع قليلا فقط من قطر طرف إبرة بوروسيليكاتي وتقع في منتصف الطريق بين الجنين وجدار طبق الوزن.
من الأسهل عموما الحقن عند النقطة المجاورة مباشرة لتشعب الوريد. اضغط على طرف الإبرة ضد جدار الأوعية الدموية وتطبيق ضغط لطيف في نفس اتجاه تدفق الدم. إذا لزم الأمر، استخدم مسحة قطنية للمساعدة في تثبيت أو تثبيت السفينة التي يتم حقنها.
قم بالاكتئاب بلطف المكبس المحاقن لمدة 2 إلى 10 ثانية حتى يتم حقن الحجم المطلوب. تجاهل الجنين إذا كان النزيف المفرط أو تراكم السائل واضحة يظهر في موقع الحقن. إزالة الإبرة من CAM وداب بلطف موقع الحقن مع مسحة القطن لإزالة أي دم أو الخلايا السرطانية الزائدة.
قم بتغطية الجنين المحقون في طبق الوزن بالغطاء وأعيده إلى الحاضنة. كرر العملية حتى يتم حقن جميع الأجنة. فحص بصريا الأجنة للبكتيريا أو تلوث العفن أو الموت.
والتخلص من الأجنة الملوثة وفقا لإجراءات التخلص من المختبرات. تأكد من أن المستعمرات النقيلية تظهر موحدة الشكل خلال أول يوم إلى ثلاثة أيام بعد الحقن. وتحديد المستعمرات النقيلية الغازية أو غير الغازية في الأيام من أربعة إلى خمسة بعد الحقن.
في اليوم الخامس بعد الحقن، قم بإزالة الأجنة من الحاضنة وفحص وتحديد موقع CAMs الجنين لتوزيع المستعمرة النقيلية. تحت المجهر تشريح، سحب بلطف الأنسجة CAM التي تحتوي على مستعمرة النقيلي من الفائدة صعودا باستخدام ملقط ناعم، وقطع عليه مع مقص الجراحية. نقل الأنسجة CAM في فارغة، أنبوب 1.5 ملليلتر عقيمة وإغلاق غطاء أنبوب.
كرر إجراء ختان حتى يتم جمع جميع المستعمرات ذات الاهتمام في أنابيب منفصلة. فرم بلطف الأنسجة CAM في أنبوب الطرد المركزي الصغيرة، وذلك باستخدام إبرة منفصلة معقمة قياس 18 لكل مستعمرة. أضف 100 ميكرولتر من محلول الكولاجين -A 1X واحتضن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
تدور أسفل الخلايا والأنسجة CAM في 300 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة الحرارة المحيطة. يستنشق الكولاجين-A الحل وإعادة تعليق الخلايا وسائل الإعلام غير مكتملة لخط الخلية من الفائدة. ثم تدور الخلايا والأنسجة مرة أخرى.
إعادة تعليق الخلايا وقطع الأنسجة في ملليلتر واحد من الوسائط الكاملة وعامل الاختيار، إن وجد. ثم نقل إلى طبق واحد زراعة الأنسجة 12 جيدا. خلال الأسابيع الثلاثة القادمة، قم بمراقبة الخلايا السرطانية يوميا بحثا عن النمو والتلوث.
عندما تصل الخلايا إلى 70 إلى 80٪ من التقاء نقلها إلى طبق ثقافة حجم أكبر. انتقل إلى التسلسل أو الجولة التالية من الاختيار ، بمجرد الوصول إلى أعداد كافية من الخلايا السرطانية. الأجنة التي تظهر تراكم الخلايا السرطانية بسبب الحقن غير الناجح ، يمكن رؤيتها في معظم الشعيرات الدموية.
عندما يتم تحقيق تركيز الخلايا الأمثل ومدة الحقن، يجب أن تنتج الخلايا المنقولة بعد الحقن في اليوم الخامس مجموعة واسعة من الأنماط الظاهرية للمستعمرة، مع معظم المستعمرات الغازية كما تحددها الخلايا السرطانية التي تظهر متناثرة في أنسجة CAM. وينبغي إيلاء الاهتمام للمستعمرات النقيلي التي تبدو مدمجة وتقع بعيدا بما فيه الكفاية عن المستعمرات المجاورة التي يمكن استئصالها مع ملقط ومقص وقطعة واحدة من الأنسجة CAM. يجب أن تعرض ضربة الشاشة الإيجابية المعزولة النمط الظاهري للمستعمرة المدمجة عند إعادة الحقن.
لقياس الاتصالات الأوعية الدموية الخلايا السرطانية, وينبغي إيلاء الاهتمام لسطوع وصمة عار جدار الأوعية الدموية وينبغي حقن الكمية المناسبة من الليكتينات للإشارة جدار الأوعية الدموية. عند محاولة هذا البروتوكول تجنب تحت أو أكثر من الحقن وإزالة النزيف المفرط أو تراكم السائل. وقد تم تحديد العديد من الجينات الجديدة التي تدفع غزو الخلايا السرطانية في المشاهد باستخدام هذه التقنية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يتيح هذا البروتوكول تحديد الجينات أو مجموعات الجينات التي تمنع غزو السرطان بشكل فعال. من خلال استخدام الأوعية الدموية لغشاء الكوريواللانتويس للدجاج، يمكن للباحثين فحص مثبطات أو محفزات انبثاث السرطان.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا السرطان
- العلاج الجيني
- بحوث الانبثاث
الخلفية
- فهم انبثاث السرطان أمر بالغ الأهمية لتطوير علاجات فعالة.
- قد تتطلب الطرق التقليدية مرافق حيوانية متقدمة.
- يمكن تسريع الفحص باستخدام هذه الطريقة.
- تحديد أهداف علاجية جديدة ضروري للعلاج من السرطان.
غرض الدراسة
- اكتشاف أهداف الجينات التي يمكن أن تمنع انبثاث السرطان.
- استخدام نظام فحص عالي الإنتاجية من أجل الكفاءة.
- تأكيد الأنماط الظاهرية للمستعمرات المحددة.
الطرق المستخدمة
- نقل الخلايا بمكتبة تعبير.
- حقن الخلايا في غشاء الكوريواللانتويس للدجاج.
- استئصال وتوسيع المستعمرات المنتشرة.
- تسلسل عالي الإنتاجية للتحليل.
النتائج الرئيسية
- تحديد المستعمرات ذات الغزو المتغير.
- تأكيد الأنماط الظاهرية من خلال إعادة الحقن.
- الاكتشاف المحتمل لأهداف جينات علاجية جديدة.
الاستنتاجات
- توفر هذه الطريقة أسلوبًا سريعًا لفحص مثبطات انبثاث السرطان.
- يمكن أن يؤدي إلى تحديد استراتيجيات علاجية جديدة.
- استخدام نموذج الدجاج يقلل من الحاجة إلى مرافق حيوانية معقدة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
The chick chorioallantoic membrane (CAM) model enables rapid, quantitative screening for metastasis regulators in a living, vascularized system without requiring advanced animal facilities. This approach supports early target validation by identifying genes that modulate cancer cell invasion and vascular interactions, providing mechanistic de-risking for therapeutic hypothesis testing. The platform accelerates discovery of anti-metastatic targets, informing portfolio prioritization in oncology drug development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by identifying genes that suppress or promote cancer cell invasion in a dynamic microenvironment.
- Operational Value: Enables functional validation of targets through colony excision, phenotypic confirmation, and reinjection assays.
- Predictive Value: Supports preclinical de-risking by linking genetic hits to metastatic behavior in a collagen-rich, vascularized tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, image-based readouts of colony invasiveness to distinguish metastatic from non-metastatic phenotypes.
- Operational Value: Standardizes xenografting and selection procedures across embryos, reducing variability in screening outcomes.
- Scalability: Compatible with shRNA library screening, allowing genome-scale interrogation of metastasis regulators in weeks.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase target identification to downstream validation via primary tumor formation and vasculature co-option assays.
- Mechanistic Insight: Enables analysis of cancer cell–blood vessel interactions, informing anti-angiogenic or vascular co-option strategies.
- Predictive Confidence: Multiple selection rounds reduce false positives, increasing confidence in target validity before lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The CAM model fits within the early discovery continuum, supporting target identification and validation prior to lead optimization and preclinical efficacy studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven screening for metastasis regulators using genetic libraries and quantitative phenotyping.
- Screening: Delivers standardized, reproducible colony formation and invasion metrics for compound or genetic modulator evaluation.
- Analytics: Provides image-based quantification of invasiveness and vascular contact, enabling statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Supports progression from hit identification to functional validation in orthotopic and co-option assays.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for screening metastasis modifiers across cancer types and genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in metastasis regulation by linking genes to invasive phenotypes in vivo.
- Operational Value: Eliminates need for murine imaging infrastructure, lowering cost and increasing throughput for target validation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative evidence of anti-metastatic activity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of targets with validated roles in invasion and vascular interaction.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryo handling, microinjection, and stereoscopic microscopy.
- Dependent on sterile tissue culture, collagen-A dissociation, and molecular biology tools for shRNA library work.
- Necessitates standardized imaging protocols for consistent colony phenotyping across operators and sessions.
- Adaptation to other cancer models may require optimization of cell concentration, injection volume, and incubation time.
- Limited to avascularized, early-stage metastatic phenotypes; may not capture late-stage colonization or stromal interactions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:41
Intravenous Injection of Cancer Cells for Metastatic Colony Formation
3:06
Embryo Maintenance During the Metastatic Colony Growth and their Isolation
5:26
Results: Metastatic Colony Isolation for Different Steps of the Screening Protocol
6:34
Conclusion
