اكتشاف المنظمين النقيلي باستخدام نموذج الغشاء السريع والكمي داخل الفرخ Chorioallantoic

يسمح بروتوكولنا بتحديد فعال لتركيبات الجينات أو الجينات التي تمنع غزو السرطان في المشاهد. على الثقافة لا يتطلب متقدمة مرافق لصيانة. ككل ، يمكن فحص مكتبات عامة أو عامة خاصة في غضون عدة أسابيع في المشاهد.

وسيساعد هذا النظام على فحص الباحثين اكتشاف أهداف الجينات العلاجية الجديدة أو مجموعات الأهداف الجينية التي يمكن استخدامها لمنع الانبثاث السرطان. لحقن IV، ركز الخلايا إلى 0.5 إلى 1 مليون خلية لكل ملليلتر، باستخدام الجليد البارد 1X PBS لتخفيف أو إعادة تعليق الخلايا. نتوقع ما يقرب من ملليلتر واحد من تعليق الخلية ستكون هناك حاجة لكل 10 أجنة.

لتجميع جهاز الحقن، قم بتركيب إبرة على الحقنة، ثم قم بتمديد إبرة الحقن بقطعة أنابيب طولها من ثلاثة إلى خمسة سنتيمترات. كسر غيض من إبرة borosilicate باستخدام ملقط غرامة. تحميل المحاقن مع 50 إلى 200 ميكرولتر من تعليق الخلايا السرطانية.

وأدخل إبرة البوروسيليكات في الأنابيب. فحص الإبرة لانسداد الخلايا وفقاعات الهواء. إذا لوحظ انسداد الخلايا داخل الشعرية، قم بإزالة الشعرية، وإعادة تعليق الخلايا واستبدالها بشعيرات شعرية جديدة.

استخدام المكبس لدفع أي فقاعات. قم بإزالة غطاء الغطاء ونقل الجنين تحت المجسم. تحديد الوريد المناسب لحقنها على سطح CAM;الذي عادة ما يكون أوسع قليلا فقط من قطر طرف إبرة بوروسيليكاتي وتقع في منتصف الطريق بين الجنين وجدار طبق الوزن.

من الأسهل عموما الحقن عند النقطة المجاورة مباشرة لتشعب الوريد. اضغط على طرف الإبرة ضد جدار الأوعية الدموية وتطبيق ضغط لطيف في نفس اتجاه تدفق الدم. إذا لزم الأمر، استخدم مسحة قطنية للمساعدة في تثبيت أو تثبيت السفينة التي يتم حقنها.

قم بالاكتئاب بلطف المكبس المحاقن لمدة 2 إلى 10 ثانية حتى يتم حقن الحجم المطلوب. تجاهل الجنين إذا كان النزيف المفرط أو تراكم السائل واضحة يظهر في موقع الحقن. إزالة الإبرة من CAM وداب بلطف موقع الحقن مع مسحة القطن لإزالة أي دم أو الخلايا السرطانية الزائدة.

قم بتغطية الجنين المحقون في طبق الوزن بالغطاء وأعيده إلى الحاضنة. كرر العملية حتى يتم حقن جميع الأجنة. فحص بصريا الأجنة للبكتيريا أو تلوث العفن أو الموت.

والتخلص من الأجنة الملوثة وفقا لإجراءات التخلص من المختبرات. تأكد من أن المستعمرات النقيلية تظهر موحدة الشكل خلال أول يوم إلى ثلاثة أيام بعد الحقن. وتحديد المستعمرات النقيلية الغازية أو غير الغازية في الأيام من أربعة إلى خمسة بعد الحقن.

في اليوم الخامس بعد الحقن، قم بإزالة الأجنة من الحاضنة وفحص وتحديد موقع CAMs الجنين لتوزيع المستعمرة النقيلية. تحت المجهر تشريح، سحب بلطف الأنسجة CAM التي تحتوي على مستعمرة النقيلي من الفائدة صعودا باستخدام ملقط ناعم، وقطع عليه مع مقص الجراحية. نقل الأنسجة CAM في فارغة، أنبوب 1.5 ملليلتر عقيمة وإغلاق غطاء أنبوب.

كرر إجراء ختان حتى يتم جمع جميع المستعمرات ذات الاهتمام في أنابيب منفصلة. فرم بلطف الأنسجة CAM في أنبوب الطرد المركزي الصغيرة، وذلك باستخدام إبرة منفصلة معقمة قياس 18 لكل مستعمرة. أضف 100 ميكرولتر من محلول الكولاجين -A 1X واحتضن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

تدور أسفل الخلايا والأنسجة CAM في 300 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة الحرارة المحيطة. يستنشق الكولاجين-A الحل وإعادة تعليق الخلايا وسائل الإعلام غير مكتملة لخط الخلية من الفائدة. ثم تدور الخلايا والأنسجة مرة أخرى.

إعادة تعليق الخلايا وقطع الأنسجة في ملليلتر واحد من الوسائط الكاملة وعامل الاختيار، إن وجد. ثم نقل إلى طبق واحد زراعة الأنسجة 12 جيدا. خلال الأسابيع الثلاثة القادمة، قم بمراقبة الخلايا السرطانية يوميا بحثا عن النمو والتلوث.

عندما تصل الخلايا إلى 70 إلى 80٪ من التقاء نقلها إلى طبق ثقافة حجم أكبر. انتقل إلى التسلسل أو الجولة التالية من الاختيار ، بمجرد الوصول إلى أعداد كافية من الخلايا السرطانية. الأجنة التي تظهر تراكم الخلايا السرطانية بسبب الحقن غير الناجح ، يمكن رؤيتها في معظم الشعيرات الدموية.

عندما يتم تحقيق تركيز الخلايا الأمثل ومدة الحقن، يجب أن تنتج الخلايا المنقولة بعد الحقن في اليوم الخامس مجموعة واسعة من الأنماط الظاهرية للمستعمرة، مع معظم المستعمرات الغازية كما تحددها الخلايا السرطانية التي تظهر متناثرة في أنسجة CAM. وينبغي إيلاء الاهتمام للمستعمرات النقيلي التي تبدو مدمجة وتقع بعيدا بما فيه الكفاية عن المستعمرات المجاورة التي يمكن استئصالها مع ملقط ومقص وقطعة واحدة من الأنسجة CAM. يجب أن تعرض ضربة الشاشة الإيجابية المعزولة النمط الظاهري للمستعمرة المدمجة عند إعادة الحقن.

لقياس الاتصالات الأوعية الدموية الخلايا السرطانية, وينبغي إيلاء الاهتمام لسطوع وصمة عار جدار الأوعية الدموية وينبغي حقن الكمية المناسبة من الليكتينات للإشارة جدار الأوعية الدموية. عند محاولة هذا البروتوكول تجنب تحت أو أكثر من الحقن وإزالة النزيف المفرط أو تراكم السائل. وقد تم تحديد العديد من الجينات الجديدة التي تدفع غزو الخلايا السرطانية في المشاهد باستخدام هذه التقنية.