Name: Stereocilia حزمة التصوير مع قرار نانوية في خلايا الشعر السمعي الثدييات الحية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: اكتشف تقنية HPICM لتصوير حزم السtereocilia الحية في خلايا الشعر السمعية بدقة نانومترية دون تلامس. تتيح هذه الطريقة دراسة التغيرات التركيبية الديناميكية لساعات متواصلة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر البروفيسور يوري كورشيف (إمبريال كوليدج، المملكة المتحدة) على الدعم والمشورة على المدى الطويل في جميع مراحل المشروع. كما نشكر الدكتورين بافل نوفاك وأندرو شيفتشوك (إمبريال كوليدج، المملكة المتحدة) وكذلك أوليغ بيلوف (المركز الوطني للبحوث السمعية، روسيا) على مساعدتهما في تطوير البرمجيات. تم دعم الدراسة من قبل NIDCD / NIH (R01 DC008861 و R01 DC014658 إلى G.I.F.).

<ol><li>Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+inner+hair+cell+mechanotransducer+channels+using+high-speed+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging.</a> Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).</li>
<li>Effertz, T., Becker, L., Peng, A. W., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositol-4%2C5-bisphosphate+regulates+auditory+hair-cell+mechanotransduction-channel+pore+properties+and+fast+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositol-4,5-bisphosphate regulates auditory hair-cell mechanotransduction-channel pore properties and fast adaptation.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (48), 11632-11646 (2017).</li>
<li>Peng, A. W., Gnanasambandam, R., Sachs, F., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+independent+modulation+of+auditory+hair+cell+mechanotransduction+channel+open+probability+implicates+a+role+for+the+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adaptation independent modulation of auditory hair cell mechanotransduction channel open probability implicates a role for the lipid bilayer.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (10), 2945-2956 (2016).</li>
<li>Engström, H., Engström, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+hairs+on+cochlear+sensory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Structure of the hairs on cochlear sensory cells.</a> Hearing research. 1 (1), 49-66 (1978).</li>
<li>Conchello, J. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 920-931 (2005).</li>
<li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li>
<li>Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348(2015).</li>
<li>Pickles, J. O., Comis, S. D., Osborne, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+organ+of+Corti%2C+and+their+possible+relation+to+sensory+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Cross-links between stereocilia in the guinea pig organ of Corti, and their possible relation to sensory transduction.</a> Hearing Research. 15 (2), 103-112 (1984).</li>
<li>Furness, D. N., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Cross-links between stereocilia in the guinea pig cochlea.</a> Hearing Research. 18 (2), 177-188 (1985).</li>
<li>Jacobs, R. A., Hudspeth, A. J. Ultrastructural correlates of mechanoelectrical transduction in hair cells of the bullfrog’s internal ear. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJacobs%2C+RA+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22">Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology</a>. 55, 547-561 (1990).</li>
<li>Goodyear, R. J., Marcotti, W., Kros, C. J., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+properties+of+stereociliary+link+types+in+hair+cells+of+the+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Development and properties of stereociliary link types in hair cells of the mouse cochlea.</a> The Journal of Comparative Neurology. 485 (1), 75-85 (2005).</li>
<li>Kachar, B., Parakkal, M., Kurc, M., Zhao, Y., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+structure+of+hair-cell+tip+links%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-resolution structure of hair-cell tip links.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 13336-13341 (2000).</li>
<li>Vélez-Ortega, A. C., Freeman, M. J., Indzhykulian, A. A., Grossheim, J. M., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+current+is+essential+for+stability+of+the+transducing+stereocilia+in+mammalian+auditory+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction current is essential for stability of the transducing stereocilia in mammalian auditory hair cells.</a> eLife. 6, 1-22 (2017).</li>
<li>Ivanchenko, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+scanning+electron+microscopy+of+anti-PKHD1L1+immuno-gold+labeled+mouse+hair+cell+stereocilia+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">Serial scanning electron microscopy of anti-PKHD1L1 immuno-gold labeled mouse hair cell stereocilia bundles.</a> Scientific Data. 7 (1), 182(2020).</li>
<li>Hadi, S., Alexander, A. J., Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-XVa+controls+both+staircase+architecture+and+diameter+gradation+of+stereocilia+rows+in+the+auditory+hair+cell+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology+JARO%22%5BJournal%5D)">Myosin-XVa controls both staircase architecture and diameter gradation of stereocilia rows in the auditory hair cell bundles.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology JARO. 21 (2), 121-135 (2020).</li>
<li>Metlagel, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryo-tomography+of+vestibular+hair-cell+stereocilia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron cryo-tomography of vestibular hair-cell stereocilia.</a> Journal of Structural Biology. 206 (2), 149-155 (2019).</li>
<li>Langer, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+of+individual+stereocilia+of+living+cochlear+hair+cells+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation of individual stereocilia of living cochlear hair cells by atomic force microscopy.</a> Ultramicroscopy. 82 (1-4), 269-278 (2000).</li>
<li>Dufrêne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+nanomicrobiology+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Towards nanomicrobiology using atomic force microscopy.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (9), 674-680 (2008).</li>
<li>Putman, C. A., van der Werf, K. O., de Grooth, B. G., van Hulst, N. F., Greve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelasticity+of+living+cells+allows+high+resolution+imaging+by+tapping+mode+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Viscoelasticity of living cells allows high resolution imaging by tapping mode atomic force microscopy.</a> Biophysical journal. 67 (4), 1749-1753 (1994).</li>
<li>Gavara, N., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncontact+microrheology+at+acoustic+frequencies+using+frequency-modulated+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Noncontact microrheology at acoustic frequencies using frequency-modulated atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 7 (8), 650-654 (2010).</li>
<li>Cartagena-Rivera, A. X., Van Itallie, C. M., Anderson, J. M., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+surface+supracellular+mechanical+properties+in+polarized+epithelium+using+noninvasive+acoustic+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Apical surface supracellular mechanical properties in polarized epithelium using noninvasive acoustic force spectroscopy.</a> Nature Communications. 8 (1), 1030(2017).</li>
<li>Katsuno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIOBP-5+sculpts+stereocilia+rootlets+and+stiffens+supporting+cells+enabling+hearing%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">TRIOBP-5 sculpts stereocilia rootlets and stiffens supporting cells enabling hearing.</a> JCI Insight. 4 (12), (2019).</li>
<li>Hansma, P. K., Drake, B., Marti, O., Gould, S. A., Prater, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+scanning+ion-conductance+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The scanning ion-conductance microscope.</a> Science. 243 (4891), 641-643 (1989).</li>
<li>Korchev, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+scanning+ion-conductance+microscope+for+imaging+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Specialized scanning ion-conductance microscope for imaging of living cells.</a> Journal of Microscopy. 188 (Pt 1), 17-23 (1997).</li>
<li>Shevchuk, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+proteins+in+membranes+of+living+cells+by+high-resolution+scanning+ion+conductance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+ed+in+English%22%5BJournal%5D)">Imaging proteins in membranes of living cells by high-resolution scanning ion conductance microscopy.</a> Angewandte Chemie (International ed in English. 45 (14), 2212-2216 (2006).</li>
<li>Novak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+live-cell+imaging+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale live-cell imaging using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Nature Methods. 6 (4), 279-281 (2009).</li>
<li>Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+live+cochlear+stereocilia+at+a+nanoscale+resolution+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of live cochlear stereocilia at a nanoscale resolution using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1427, 203-221 (2016).</li>
<li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+scanning+patch-clamp%3A+new+insights+into+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">High-resolution scanning patch-clamp: new insights into cell function.</a> FASEB Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (7), 748-750 (2002).</li>
<li>Frolenkov, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+recordings+from+the+apical+surface+of+outer+hair+cells+with+a+scanning+ion+conductance+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Single-channel recordings from the apical surface of outer hair cells with a scanning ion conductance probe.</a> Association for Research in Otolaryngology. Abs. 444, (2004).</li>
<li>Sánchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncontact+measurement+of+the+local+mechanical+properties+of+living+cells+using+pressure+applied+via+a+pipette%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Noncontact measurement of the local mechanical properties of living cells using pressure applied via a pipette.</a> Biophysical Journal. 95 (6), 3017-3027 (2008).</li>
<li>Korchev, Y. E., Negulyaev, Y. A., Edwards, C. R., Vodyanoy, I., Lab, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+localization+of+single+active+ion+channels+on+the+surface+of+a+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional localization of single active ion channels on the surface of a living cell.</a> Nature Cell Biology. 2 (9), 616-619 (2000).</li>
<li>Shevchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angular+approach+scanning+ion+conductance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Angular approach scanning ion conductance microscopy.</a> Biophysical Journal. 110 (10), 2252-2265 (2016).</li>
<li>Furness, D. N., Katori, Y., Nirmal Kumar, B., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dimensions+and+structural+attachments+of+tip+links+in+mammalian+cochlear+hair+cells+and+the+effects+of+exposure+to+different+levels+of+extracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The dimensions and structural attachments of tip links in mammalian cochlear hair cells and the effects of exposure to different levels of extracellular calcium.</a> Neuroscience. 154 (1), 10-21 (2008).</li>
</ol>

ولا توجد مصالح متنافسة بين أصحاب البلاغ.

للحصول على صور HPICM ناجحة، يحتاج المستخدمون إلى إنشاء نظام منخفض الضوضاء والاهتزاز منخفضة وتصنيع ماصة المناسبة. نوصي بشدة باستخدام معايير معايرة AFM لاختبار استقرار النظام قبل محاولة إجراء أي تصوير للخلايا الحية. بمجرد اختبار دقة النظام ، يمكن للمستخدمين النظر في تصوير الجهاز الثابت لعينات كورتي للتعرف على إعدادات التصوير قبل محاولة أي تصوير للخلايا الحية.
تختلف نقطة الإعداد المثلى للتصوير بين ماصة مختلفة ، اعتمادا على الشكل الفردي لنصائحها (غير معروف حتى يتم فحصها عن طريق المجهر الإلكتروني) ...

على الرغم من حقيقة أن حزم المجسمة في خلايا الشعر السمعية كبيرة بما يكفي لتصورها عن طريق المجهر البصري وانحرافها في الخلايا الحية في تجربة المشبك التصحيح ، يمكن تصوير المكونات الهيكلية الأساسية لآلات النقل مثل روابط البقشيش فقط مع المجهر الإلكتروني في الخلايا الميتة. في خلايا الشعر السمعي الثديي ، تقع آلات النقل في الطرف السفلي من روابط الطرف ، أي على أطراف الصف الأقصر stereocilia1 وتنظم محليا من خلال الإشارات على نصائح من stereocilia2،3. ومع ذلك ، فإن التصوير الخالي من التسمية للهياكل السطحية في هذا الموقع في خلايا الشعر الحية غير ممكن بسبب الأحجام الصغيرة من الاستريوسيليا.
القوقعة الثديية لديها نوعين من الخلايا الحسية السمعية: خلايا الشعر الداخلية والخارجية. في خلايا الشعر الداخلية، ستيريوسيليا أطول وأكثر سمكا بالمقارنة مع تلك الموجودة في خلايا الشعر الخارجي4. الصف الأول والثاني من ستيريوسيليا يبلغ قطرها 300-500 نانومتر في الماوس أو الفئران خلايا الشعر الداخلية. نظرا لحيود الضوء ، فإن الحد الأقصى للدقة القابلة للتحقيق باستخدام مجهر بصري خال من التسمية هو حوالي 200 نانومتر. وبالتالي ، فإن تصور المجسمة الفردية داخل الصفين الأول والثاني من حزمة خلايا الشعر الداخلية أمر سهل نسبيا مع المجهر البصري. في المقابل، أقصر صف مجسمة في خلايا الشعر الداخلية وجميع مجسمة من خلايا الشعر الخارجي لها أقطار حول 100-200 نانومتر ولا يمكن تصور مع المجهر البصري5. على الرغم من التقدم الأخير في التصوير فائق الدقة ، إلا أن هذا القيد الأساسي لا يزال قائما في أي تصوير بصري خال من التسمية. جميع التقنيات المتاحة تجاريا الحالية فائقة الدقة لا تتطلب نوعا من جزيئات الفلورسنت6، مما يحد من تطبيقاتها. بالإضافة إلى القيود بسبب الحاجة إلى جزيئات محددة الموسومة الفلورسنت، وقد ثبت التعرض للإشعاع الضوء المكثف للحث على الضرر الخلوي، ويمكن أن تؤثر على العمليات الخلوية، وهو عيب كبير عند دراسة الخلايا الحية7.
وقد تم الحصول على معرفتنا الحالية من التفاصيل ultrastructural من حزم مجسمة خلايا الشعر في الغالب مع مختلف تقنيات المجهر الإلكتروني (EM) ، مثل المسح المجهري الإلكتروني (SEM)، المجهر الإلكتروني الإرسال (TEM)، تجميد كسر EM، ومؤخرا مع تقنيات 3D مثل تقسيم المسلسل مع شعاع أيون مركزة أو التصوير المقطعي cryo-EM8،9،10،11،12،13، 14،15،16. لسوء الحظ، تتطلب جميع تقنيات EM هذه إزالة كيميائية أو التبريد للعينة. اعتمادا على النطاق الزمني للظواهر ، وهذا الشرط يجعل دراسة العمليات الديناميكية في نصائح من stereocilia إما مستحيلة أو كثيفة العمالة جدا.
بذلت جهود محدودة لتصوير حزم الشعر من خلايا الشعر الحية مع المجهر القوة الذرية (AFM)17،18. منذ AFM يعمل في الحلول الفسيولوجية، فإنه يمكن، من الناحية النظرية، تصور التغيرات الديناميكية في حزم ستيريوسيليا من خلايا الشعر الحية مع مرور الوقت. تكمن المشكلة في مبادئ AFM عالية الدقة ، والتي تنطوي على اتصال جسدي معين بين مسبار AFM والعينة ، حتى في وضع "التنصت" الأقل ضررا19. عندما يواجه مسبار AFM مجسما ، فإنه عادة ما يصطدم به ، مما يضر ببنية حزمة الشعر. ونتيجة لذلك، هذه التقنية ليست مناسبة لتصور العيش، أو حتى ثابتة، حزم خلايا الشعر17،18. قد يتم تخفيف المشكلة جزئيا باستخدام مسبار AFM كبير على شكل كرة يفرض فقط القوى الهيدروديناميكية على سطح العينة20. ومع ذلك ، على الرغم من أن مثل هذا المسبار مناسب بشكل مثالي لاختبار الخصائص الميكانيكية للعينة21، فإنه يوفر فقط دقة دون ميكرومتر عند تصوير جهاز Corti22 ولا يزال ينطبق على العينة قوة قد تكون كبيرة لحزم الاستريوميليا الحساسة للغاية.
المسح المجهري توصيل أيون (SICM) هو نسخة من المسح المجهري التحقيق الذي يستخدم مسبار ماصة زجاجية مليئة محلول موصل23. يكتشف SICM السطح عندما تقترب المصصة من الخلية وينخفض التيار الكهربائي من خلال المصصة. وبما أن هذا يحدث قبل لمس الخلية ، فإن SICM مناسب بشكل مثالي للتصوير غير الاتصالي للخلايا الحية في الحل الفسيولوجي24. أفضل قرار من SICM هو على ترتيب نانومتر واحد، والذي يسمح حل مجمعات البروتين الفردية في غشاء البلازما من خلية حية25. ومع ذلك ، على غرار تقنيات مسبار المسح الأخرى ، فإن SICM قادر على تصوير الأسطح المسطحة نسبيا فقط. تغلبنا على هذا القيد عن طريق اختراع القفز مسبار أيون المجهر التوصيل (HPICM)26، الذي يقترب nanopipette العينة في كل نقطة التصوير(الشكل 1A). باستخدام HPICM، كنا قادرين على صورة حزم stereocilia في خلايا الشعر السمعية الحية مع دقة نانوية27.
ميزة أساسية أخرى لهذه التقنية هي أن HPICM ليست فقط أداة تصوير. على النقيض من تقنيات مسبار المسح الضوئي الأخرى ، فإن مسبار HPICM / SICM هو قطب كهربائي يستخدم على نطاق واسع في فسيولوجيا الخلايا للتسجيلات الكهربائية والتسليم المحلي لمختلف المحفزات. نشاط قناة أيون لا تتداخل عادة مع التصوير HPICM، لأن التيار الكلي من خلال التحقيق HPICM هو عدة أوامر من حجم أكبر من التيار خارج الخلية التي تم إنشاؤها بواسطة أكبر القنوات الأيونية25. ومع ذلك، HPICM يسمح تحديد المواقع الدقيقة للnanopipette على هيكل من الاهتمام وتسجيل التصحيح المشبك قناة واحدة لاحقة من هذا الهيكل28. هذه هي الطريقة التي حصلنا على التسجيلات الأولية الأولى من نشاط قناة واحدة في نصائح من خلية الشعر الخارجي stereocilia29. ومن الجدير بالذكر أنه حتى تيار كبير من خلال nanopipette لا يمكن أن تنتج تغييرات كبيرة في الإمكانات عبر غشاء البلازما بسبب تحويلة كهربائية هائلة من المتوسط خارج الخلية. ومع ذلك، يمكن تنشيط القنوات الأيونية الفردية ميكانيكيا عن طريق تدفق السائل من خلال nanopipette30 أو كيميائيا عن طريق التطبيق المحلي لناهض31.
في HPICM، يتم إنشاء الصورة عندما تقترب nanopipette من العينة بشكل تسلسلي عند نقطة واحدة، وتتراجع، ثم تتحرك في اتجاه الجانبي لتكرار النهج (الشكل 1A). مكبر للصوت المشبك التصحيح ينطبق باستمرار الجهد إلى سلك AgCl في ماصة (الشكل 1B) لتوليد تيار من ~ 1 ن أ في حل الحمام. يتم تحديد قيمة هذا التيار عندما يتم تحديد ماصة بعيدا عن سطح الخلية كتيار مرجعي (أناالمرجع، الشكل 1C). ثم ينتقل المواسير في المحور Z للاقتراب من العينة حتى يتم تقليل التيار بمقدار معرف مسبقا من قبل المستخدم (نقطة تعيين)، وعادة 0.2٪-1٪ من المرجع الأول (الشكل 1C، تتبع أعلى). ثم يحفظ النظام قيمة Z في هذه اللحظة كطول العينة، جنبا إلى جنب مع إحداثيات X و Y لنقطة التصوير هذه. ثم يتم سحب ماصة بعيدا عن السطح(الشكل 1C،تتبع أسفل) بسرعة يحددها المستخدم، وعادة 700-900 نانومتر / مللي ثانية. بعد التراجع ، يتم نقل ماصة (أو ، في حالتنا ، العينة - انظر الشكل 1B)أفقيا إلى نقطة التصوير التالية ، ويتم الحصول على قيمة مرجعية جديدة الحالية ، ويقترب المصصة مرة أخرى من العينة ، وتكرار العملية. ويفضل حركة X-Y من ماصة في إعداد المجهر تستقيم التي تستخدم عادة لتسجيلات تيارات خلية الشعر mechanotransduction. في هذا الإعداد، يقترب مسبار HPICM من حزم خلايا الشعر ليس من الأعلى ولكن بزاوية32. ومع ذلك ، يتم تحقيق أفضل دقة للتصوير HPICM في إعداد المجهر المقلوب(الشكل 1A، B) ، حيث يتم إزالة حركة العينة في اتجاهات X-Y من حركة Z من nanopipette ، وبالتالي القضاء على القطع الأثرية الميكانيكية المحتملة.
باستخدام HPICM، حصلنا على الصور الطبوغرافية من الماوس والفأر الداخلية والخارجية حزم ستيريوسيليا خلية الشعر، وحتى تصور الروابط بين ستيريوسيليا التي هي حوالي 5 نانومتر في القطر26،27. نجاح التصوير حزمة خلايا الشعر مع هذه التقنية يعتمد على عدة عوامل. أولا، يجب أن يكون الضجيج (التباين) لتيار nanopipette صغيرا قدر الإمكان للسماح بأقل نقطة تعيين ممكنة للتصوير HPICM. تسمح نقطة تعيين منخفضة للتحقيق HPICM ب "استشعار" سطح ستيريوسيليا على مسافة أكبر وفي أي زاوية لنهج المسبار ، ومن المدهش أنه يحسن دقة X-Y للتصوير HPICM (انظر المناقشة). ثانيا، ينبغي تخفيض الاهتزازات والانجرافات في النظام إلى أقل من 10 نانومتر، لأنها تسهم مباشرة في القطع الأثرية التصوير. وأخيرا، على الرغم من أن المسبار HPICM ومرحلة العينة يتم نقلها في محاور Z و X-Y بواسطة مشغلات بيزو التي يتم التحكم فيها من خلال التغذية المرتدة التي تحتوي على دقة نانومتر واحد أو أفضل، فإن قطر طرف nanopipette يحدد انتشار التيار (حجم الاستشعار) وبالتالي القرار (الشكل 1A). لذلك ، قبل تصوير خلايا الشعر الحية ، من الضروري سحب المصايب الكافية ، والوصول إلى الدقة المطلوبة مع عينات المعايرة ، وتحقيق ضوضاء منخفضة في نظام التسجيل.
على الأقل بضعة عقود، تقنية SICM لم تكن متاحة تجاريا، وأنها قد تم تطويرها من قبل عدد قليل فقط من المختبرات في العالم مع المختبر الرائدة من البروفيسور كورشيف في الكلية الإمبراطورية (المملكة المتحدة). في الآونة الأخيرة، أصبحت العديد من أنظمة SICM متاحة تجاريا (انظر جدول المواد)،وكلها تستند إلى مبادئ HPICM الأصلية. ومع ذلك ، فإن حزم التصوير المجسمة في خلايا الشعر تتطلب العديد من التعديلات المخصصة التي تشكل تحديا تقنيا (أو حتى مستحيلا) في أنظمة "الجاهزة" المغلقة. لذلك، هناك حاجة إلى بعض التكامل بين المكونات. منذ إعداد HPICM يمثل تلاعب المشبك التصحيح مع الاهتزاز أكثر صرامة ومتطلبات الانجراف وحركة بيزو يحركها من المسبار HPICM والعينة (الشكل 1D)، وهذا التكامل من السهل نسبيا لأي باحث، الذي يتقن في لقط التصحيح. ومع ذلك ، فإن عالما من دون خلفية مناسبة تحتاج بالتأكيد بعض التدريب في علم الفيزيولوجيا الكهربائية أولا. على الرغم من التحديات المتبقية مثل زيادة سرعة التصوير (انظر المناقشة)، تمكنا من تصوير حزم stereocilia في خلايا الشعر الحية بدقة نانوية دون إتلافها.
تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا لإجراء تصوير HPICM ناجح لحزم خلايا الشعر السمعية الحية في الفئران الصغيرة بعد الولادة أو النباتات الخارجية ل قوقعة الماوس باستخدام نظامنا المخصص. يتم سرد المكونات المتكاملة في جدول المواد. كما توضح الورقة المشاكل الشائعة التي يمكن مواجهتها وكيفية استكشافها وإصلاحها.

<table><tbody><tr><td>راسم الذبذبات التناظري</td><td>B & </td> راسم الذبذبات التناظري K Precision <td>2160C</td><td>للمراقبة في الوقت الفعلي لتيار الماصات النانوية ونهج المحور Z</td></tr><tr><td>معايير معايرة AFM</td><td>TED PELLA Inc</td><td>HS-100MG ؛ HS-20MG</td><td>تستخدم معايير المعايرة 100 و 20 نانومتر هذه لاختبار أداء نظام HPICM</td></tr><tr><td>عازل الاهتزاز على المنضدة</td><td>AMITEK / TMC</td><td>Everstill: K-400</td><td>عزل الاهتزاز النشط</td></tr><tr><td>الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات</td><td>العالمية للأدوات الدقيقة العالمية (WPI)</td> <td>1B100F-4</td><td>الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات للماصات النانوية</td></tr><tr><td>D- (+) - الجلوكوز</td><td>سيجما-ألدريتش</td><td>G8270</td><td>لإضافته إلى حل الحمام لضبط الأسمولية</td></tr><tr><td>محول الأرقام</td> National <td>Instruments Corporation</td><td>PCI-6221</td><td>محول رقمي متعدد القنوات للإدخال / الإخراج</td></tr> تحكم <tr><td>سريع في التناظرية النسبية التكاملية والمشتقة (PID) لحركة Z</td><td>وحدات Standford Research Systems</td><td>SIM900 و SIM960 و SIM980</td><td>مدمجة في وحدة تحكم PID خارجية لحركة Z. يتطلب استجابة سريعة لا يتم تنفيذها عادة في مكبرات الصوت التجارية بيزو.</td></tr><tr><td>قفص فاراداي</td><td>AMITEK / TMC</td><td>النوع الثاني</td><td>مطلوب لحماية التداخل الكهرومغناطيسي</td></tr><tr><td>طبق القاع الزجاجي</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td> <td>FD5040-100</td><td>يستخدم كطبق للغرفة للأنسجة</td></tr><tr><td>محلول الملح المتوازن هانكس (HBSS)</td> <td>Gibco ، Thermo Fisher Scientific</td><td>14025092</td><td>محلول خارج الخلية (الحمام)</td></tr><tr><td>مضخم الأجهزة</td><td>Brownlee </td> يوفر مضخم الأجهزة <td>Precision Model 440</td><td>التعويضات المطلوبة والتصفية والتكبير أو التوهين الثانوي</td></tr><tr><td>مجتذب الماصات الدقيقة القائم على الليزر</td><td>مجتذب</td> الماصات الدقيقة <td>P-2000 / G</td><td>لتصنيع الماصات النانوية. الليزر ضروري لماصات الكوارتز الحادة.</td></tr><tr><td>L-15 من Lebovitz ، بدون الفينول الأحمر</td><td>Gibco ، Thermo Fisher Scientific</td><td>21083027</td><td>محلول خارج الخلية (الحمام)</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Scientifica</td><td>PatchStar</td><td>يستخدم لتحديد المواقع "الدورة" لمشغل Z piezo</td></tr><tr><td>المجهر نيكون</td><td></td><td>Eclipse TS100</td><td>مجهر بصري مقلوب</td></tr><tr><td>مضخم</td><td>التصحيح الأجهزة الجزيئية</td><td>Axopatch 200B</td><td>يقيس مضخم مشبك التصحيح التيار من خلال معبر النانو</td></tr><tr><td>معبر Piezo للصوت (محاور XY)</td><td>Physik Instrumente (PI)</td> <td>E-500.00 ، E-505.00 ، E-509. </td><td>تضخيم C2A والتحكم PID لمرحلة ترجمة بيزو XY</td></tr><tr><td>مضخم بيزو (المحور Z)</td><td>Piezosystem jena</td><td>ENT 400 & 800</td><td>مكبر للصوت مخصص يتكون من مصدر طاقة ENT 400 واثنين من مكبرات الصوت ENT 800 بالتوازي لتحقيق أقصى تيار من 1.6 nA</td></tr><tr><td>Plasticslips</td><td>TED PELLA Inc</td><td>26028</td><td>تستخدم في تصنيع غرف الأنسجة & nbsp ؛</td></tr><tr><td>وحدة تحكم وبرامج SICM *</td> <td>Ionscope ، المملكة المتحدة (ionscope.com)</td> <td>N / A</td><td>وحدة تحكم مخصصة تعتمد على لوحة معالجة الإشارات الرقمية SBC6711 من Innovative Integration Ltd</td></tr><tr><td>Silicone elastomer (Sylgard)</td> <td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>SYLG184</td><td>تستخدم لربط الألياف الزجاجية المرنة بالغرفة</td></tr><tr><td>لغراء السيليكون</td> الأنسجيال <td>شركة داو للكيماويات</td><td>734</td><td>تستخدم للصق الأجزاء المختلفة من الغرفة للأنسجة</td></tr><tr><td>قضيب التنغستن</td><td>أنظمة AM</td><td>717500</td><td>تستخدم لتثبيت خيوط خيط تنظيف الأسنان في الغرفة للأنسجة</td></tr><tr><td>XY بيزو nanopositioner</td><td>Physik Instrumente (PI)</td> <td>P-733.2DD</td><td>XY مرحلة الترجمة مع أجهزة استشعار سعوية</td></tr><tr><td>Z بيزو نانو موضعي</td><td>Piezosystem jena</td><td>RA 12/24 SG</td><td>Ring piezoactuator مع مستشعر مقياس الإجهاد</td></tr><tr><td>* لم يعد Ionscope يبيع وحدات تحكم SICM منفصلة بعد الآن. هناك عدد قليل من الأنظمة التجارية الأخرى:&nbsp; NX12-Bio و NX10 SICM,&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr> وحدات <tr><td>Park Systems وكوريا و SICM من ICAPPIC Limited ، المملكة المتحدة (icappic.com). كل هذه الأنظمة تستند إلى الأصل &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>مبادئ HPICM. ومع ذلك ، فإن تصوير حزم الأهداب المجسمة في خلايا الشعر يتطلب العديد من التعديلات المخصصة التي هي تقنيا &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>تحدي (أو حتى مستحيل) في مغلقة " جاهز للذهاب" أنظمة مثل Ionscope أو NX12-Bio / NX10. حاليا ، هناك واحد فقط &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>نظام معياري (ICAPPIC) لديه المرونة لتناسب أي تجربة SICM/HPICM ولكنه يتطلب بعض تكامل المكونات.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

stereocilia حزمة التصوير مع قرار نانوية في خلايا الشعر السمعي الثدييات الحية

Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells

خلايا شعر الأذن الداخلية الكشف عن التشريد الناجم عن الصوت ونقل هذه المحفزات إلى إشارات كهربائية في حزمة الشعر التي تتكون من ستيريوسيليا التي يتم ترتيبها في صفوف من ارتفاع متزايد. عندما يتم تحويل stereocilia، فإنها سحب على صغيرة (~ 5 نانومتر في القطر) طرف خارج الخلية يربط ستيريوسيليا، والتي تنقل القوات إلى قنوات نقل حساسة ميكانيكيا. على الرغم من أن الميكانوترانسدوكشن قد درس في خلايا الشعر الحية لعقود، فإن التفاصيل الهيكلية الفائقة المهمة وظيفيا لآلات النقل الميكانيكي على نصائح من المجسمة (مثل ديناميات وصلة تلميح أو إعادة عرض المجسمة المعتمدة على النقل) لا يزال من الممكن دراستها فقط في الخلايا الميتة مع المجهر الإلكتروني. نظريا، تقنيات مسبار المسح الضوئي، مثل المجهر القوة الذرية، لديها ما يكفي من الدقة لتصور سطح المجسمة. ومع ذلك ، بغض النظر عن وضع التصوير ، حتى أدنى اتصال من مسبار المجهر القوة الذرية مع حزمة مجسمة عادة ما يضر حزمة. هنا نقدم بروتوكول مفصل للقفز التحقيق أيون التوصيل المجهري (HPICM) التصوير من خلايا الشعر السمعي القوارض الحية. تسمح تقنية مسبار المسح الضوئي غير التلامسية هذه بتصوير سطح الخلايا الحية بطيوغرافيا معقدة ، مثل خلايا الشعر ، بدقة نانومتر واحدة ودون إجراء اتصال مادي مع العينة. يستخدم HPICM تيارا كهربائيا يمر عبر النانوبايت الزجاجي للكشف عن سطح الخلية بالقرب من المصصة ، في حين يقوم نظام كهرومغناطيس ثلاثي الأبعاد بمسح السطح وتوليد صورته. مع HPICM ، تمكنا من تصوير حزم stereocilia والروابط التي تربط ستيريوسيليا في خلايا الشعر السمعية الحية لعدة ساعات دون ضرر ملحوظ. نتوقع أن استخدام HPICM سيسمح بالاستكشاف المباشر للتغيرات الهيكلية الفائقة في الاستريوفيلية لخلايا الشعر الحية لفهم أفضل لوظيفتها.

يمكن استخدام البروتوكول المعروض في هذه الورقة لتصور أي خلايا حية ذات تضاريس معقدة. بعد هذه الخطوات، نحصل بشكل روتيني على صور لحزم خلايا الشعر السمعية الحية للفئران (الشكل 6B، D). على الرغم من وجود انخفاض دقة X-Y بالمقارنة مع صور SEM ، يمكن لصور HPICM لدينا حل الصفوف المختلفة من الاستريوفيليا ، وشكل نصائح ستيريوسيليا ، وحتى الروابط الصغيرة (~ 5 نانومتر في القطر) التي تربط ستيريوسيليا المجاورة(الشكل 6F). بالإضافة إلى ذلك، تحتوي صور HPICM على معلوم...

هنا نقدم بروتوكولا للتحقيق التنقل أيون التوصيل المجهر (HPICM)، وهي تقنية مسبار المسح الضوئي غير الاتصال الذي يسمح التصوير النانوي من حزم مجسمة في خلايا الشعر السمعية الحية.

Stereocilia حزمة التصوير مع قرار نانوية في خلايا الشعر السمعي الثدييات الحية

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia ...

هذا العملية يمكن أن تساعدنا على دراسة التغيرات الديناميكية للمكونات الهيكلية نانو من آلات النقل الكهربائية الميكانيكية على سطح حزم ستيريوسيليا خلية الشعر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي التصوير الفاصل الزمني لسطح الخلايا الحية ذات التضاريس المعقدة بدقة نانومتر واحدة ، ودون إجراء اتصال مادي مع العينة. يمكن تطبيق هذه التقنية على أي خلية حية تقريبا.كنا في السابق مطابقة سطح خطوط الخلايا الظهارية الرئة المصابة بالفيروسات، والخلايا العضلية، في بلدي صورة البكتيريا قريبا. اختبار nanopipettes في بداية كل جلسة التصوير. بعد تصنيع nanopipette، تحقق من وجود فقاعات، وإزالة أي فقاعات إذا كان موجودا، وجبل nanopipette على القفز التحقيق أيون موصل حامل مجهر ماصة.في أربعة ملليلتر من حل الحمام للغرفة ووضع الغرفة على خشبة المسرح HPICM. أدخل القطب الأرضي إلى محلول الحمام وتأكد من أن الجهد الذي يتم تطبيقه على المصصة من خلال مكبر الصوت المشبك التصحيح هو صفر. بعد وضع المتلاعب الصغير في الوضع الرأسي، حرك المصصة في Z حتى تلمس السائل وتعيين إزاحة مكبر الصوت إلى الصفر، قبل إضافة زائد 100 ملليفولت للتحقق من تيار ماصة.استخدم غراء السيليكون لإرفاق معيار معايرة AFM للغرفة وتغطية العينة بأربعة ملليلترات من HBSS. استخدم الشريط على الوجهين لتأمين الغرفة إلى المرحلة X Y من إعداد HPICM، وتحميل nanopipette جديدة على حامل كما هو موضح. بعد اختبار المقاومة nanopipette وقطرها، تعيين التيار إلى واحد نانو أمبير.استخدام المتلاعب المشبك التصحيح الخشنة لوضع nanopipette تقريبا فوق مركز معيار المعايرة وزيادة نقطة مجموعة أثناء رصد إشارة من جهاز استشعار المحرك بيزو Z على الذبذبة في الوقت الحقيقي. بعد إنشاء مستقرة قابلة للتكرار Z نهج دورة، تقليل نقطة مجموعة إلى قيمة فقط فوق نقطة عدم الاستقرار وتحريك ماصة أسفل بسرعة حوالي خمسة ميكرون في الثانية الواحدة، حتى تصل إلى العينة. سوف يزيد المستوى السفلي من إشارة تحديد المواقع Z في الوقت الحقيقي ، مما يشير إلى أن يتم سحب nanopipette بسبب استشعار سطح العينة.بسبب تصاعد متفاوتة على معيار AFM، قد تكون أعلى نقطة في مجال الاهتمام غير معروف. لذلك، تعيين سعة التراجع ماصة إلى ما لا يقل عن 200 إلى 500 نانومتر. مع الحرص على عدم تجاوز الحد الأعلى لحركة مشغل بيزو Z ، ابدأ التصوير بدقة منخفضة.بمجرد تحديد أعلى نقطة للعينة في منطقة التصوير ، قم بتقليل سعة القفزة وسحب المصة حوالي 200 ميكرون على طول محور Z لمنع أي تصادم غير مرغوب فيه مع العينة قبل نقلها إلى موقع X Y جديد. عند تحديد موقع منطقة الاهتمام، ابدأ التصوير بدقة أعلى. لتصوير خلايا الشعر السمعية، تأمين بحزم جهاز معزول حديثا من كورتي إلى غرفة باستخدام إما خيط الأسنان، أو ماصة زجاجية مرنة.استخدام الشريط على الوجهين لتأمين بحزم الغرفة إلى مرحلة بيزو س ص وتحميل nanopipette جديدة على حامل كما هو موضح. بعد التحقق من مقاومة nanopipette ، استخدم المتلاعب الدقيق المشبك التصحيح لوضع nanopipette على منطقة خلايا الشعر أثناء مراقبة الجهاز من نبات كورتي X في المجهر المقلوب. سجل، في الوقت الحقيقي الحالي و Z إشارة تحديد المواقع على الذبذبة للتحقق مما إذا كان النظام مستقر مع نقطة محددة من 0.5٪ 6or أقل، وتحديد نقطة مجموعة الأمثل والنهج العينة كما هو موضح.إجراء تصوير منخفض الدقة للعينة كما هو موضح باستخدام سعة قفزة لا تقل عن ستة إلى ثمانية ميكرون. إذا كان nanopipette يحتاج إلى نقل إلى موقع جديد X Y، تراجع ماصة حوالي 500 نانومتر لتجنب الاصطدام مع أي ميزات طويل القامة داخل الأنسجة وتكرار التصوير HPICM منخفضة الدقة حتى المنطقة ذات الاهتمام حيث توجد خلايا الشعر. ثم قم بتصوير المنطقة ذات الاهتمام بدقة أعلى في 15 دقيقة أو أقل.يمكن استخدام بروتوكول HPICM لتصور أي خلايا حية ذات تضاريس معقدة ، مثل حزم خلايا الشعر السمعية الحية للفئران. على الرغم من إظهار دقة X Y أقل مقارنة بمسح صور المجهر الإلكتروني ، يمكن لصور HPICM حل الصفوف المختلفة من المجسمة بنجاح. شكل نصائح ستيريوسيليا وحتى وصلات نانومتر الخمسة الصغيرة التي تربط بين ستيريوسيليا المجاورة.نظرا لطبيعة التصوير غير المتصلة ب HPICM ، يمكن إجراء التصوير المستمر الفاصل الزمني لنفس حزمة خلايا الشعر لعدة ساعات دون الإضرار بتماسك الحزمة. لاحظ أنه مع نقطة تعيين منخفضة جدا، قد يفسر النظام التقلبات الصغيرة في التيار على أنها تواجه سطح الخلية، مما يؤدي إلى ضوضاء النقطة البيضاء في الصورة. وبالمثل، قد تزيد اتساعات القفز الكبيرة من الرنين الجانبي للمصصة، مما يؤدي أيضا إلى إنتاج وحدات بكسل صاخبة.في المقابل، إذا كانت سعة الهوب صغيرة جدا، أو كانت نقطة الإعداد مرتفعة جدا، فقد تصطدم النانوبايت بالعينة مما يؤدي إلى تصوير القطع الأثرية أو تلف حزمة الشعر. أهم شيء يجب تذكره عند محاولة هذا الإجراء هو قضاء أقل من 15 دقيقة لكل حزمة خلايا شعر عند العمل مع الخلايا الحية. بعد الحصول على صورة لحزمة الشعر ، يمكن للمرء أن يحاول الحصول على تسجيلات قناة واحدة من مواقع محددة على سطح stereocilia للإجابة على الأسئلة حول خصائص قناة mechanotransduction.

stereocilia-bundle-imaging-with-nanoscale-resolution-live-mammalian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

خلية كاملة التصحيح ، المشبك التسجيلات السمعية من التشعبات الألياف العصبية في المشبك الشعر الداخلية الشريط خلية في القوقعة الثدييات.

بعد المشبكي التسجيلات في وارد الاتصال الانشعابيات القوقعة خلايا الشعر الداخلية : رصد النسخة عديد الحويصلات في الشريط المشبك

ووصف طريقة موثوقة للتحقيق في الخلية الخارجي الشعر (OHC) ردود متحركة ، بما في ذلك electromotility ، حركية بطيئة والانحناء. وأثارت OHC حركية بواسطة التحفيز مع حقل خارجي الكهربائية بالتناوب ، وطريقة الاستفادة من تسجيل صورة عالية السرعة ، وإنارة LED مقرها ، ومشاركة برنامج تحليل الصور جيل.

التحقيق الخارجي على الحركة خلية الشعر مع مزيج من التحفيز الخارجي المتردد مجال كهربائي عالي السرعة وتحليل الصور

المصدر: Lukasz, D., et al. تصوير الكالسيوم في الجسم الحي لخلايا الشعر الجانبية في يرقات الزرد. J. Vis. Exp. (2018)يوضح هذا الفيديو التصوير الحي لتدفق الكالسيوم في خلايا الشعر الجانبية ليرقة الزرد المعدلة وراثيا مشلولة باستخدام مجهر متحد البؤر. يحفز التحفيز الميكانيكي لحزم الشعر عبر نبضات السوائل دخول الكالسيوم من خلال قنوات النقل الميكانيكي والقنوات ذات الجهد الكهربائي ، والتي يتم تصورها في الوقت الفعلي باستخدام مؤشرات التألق. تسلط الطريقة الضوء على ديناميكيات الكالسيوم القمي والقاعدي في خلايا...

تصوير ديناميكيات الكالسيوم في خلايا الشعر الجانبية لسمك الزرد اليرقي

تؤثر الأهداب الأولية على مسارات الإشارات المختلفة. تعتبر قوقعة الثدييات مثالية لفحص إشارات قطبية الخلية المستوية (PCP). يؤثر الخلل الوظيفي الأهدبي على نمو القوقعة ، والزخرفة الخلوية واتجاه خلايا الشعر ، وقراءات PCP. هدفنا هو تحليل إشارات PCP في قوقعة الفأر عن طريق تحليل النمط الظاهري والكيمياء المناعية والفحص المجهري الإلكتروني الماسح.

تقييم مستو خلية-التقاطب الظواهر في Ciliopathy ماوس المسخ القوقعة

يسمح (رنا catesbeiana) كييس الضفدع الأمريكي الفحص المباشر من علم وظائف الأعضاء خلايا الشعر. هنا يتم وصف تشريح وإعداد كييس الضفدع للدراسات الفيزيائية الحيوية. وتبين لنا تجارب تمثيلية من هذه الخلايا الشعر، بما في ذلك حساب علاقة قوة النزوح حزمة وقياس حركته السهلة.

إعداد الفسيولوجية للخلايا الشعر من كييس من ضفدع الثور (<em&gt; رنا catesbeiana</em&gt;)

ويصف هذا البروتوكول أساليب لتسجيل استجابة جذع الدماغ السمعية من الجراء الفئران بعد الولادة. دراسة تطور وظيفي لخلايا الشعر الخارجي، يرد وصف للإجراءات التجريبية لتصحيح كامل الخلية المشبك تسجيل في عزل خلايا الشعر الخارجي خطوة بخطوة.

استجابة جذع الدماغ السمعية والخارجي الشعر خلية تسجيل المشبك تصحيح كامل الخلية في الفئران بعد الولادة

الزرد هو نظام نموذج العديد من الميزات القيمة بما في ذلك الوضوح البصري، التنمية الخارجية السريعة،، وأهمية خاصة في مجال السمع والتوازن، خارجياً يقع خلايا الشعر حسية. توضح هذه المقالة الزرد كيف المحورة وراثيا يمكن استخدامها للاعتداء ميتشانوسينسيشن خلايا الشعر والدالة بريسينابتيك بكاملها.

في تصوير الكالسيوم فيفو خلايا الشعر الخط الجانبي في الزرد اليرقات

تصف هذه المخطوطة بروتوكولًا تجريبيًا لتقييم الخصائص المورفولوجية والحالة الوظيفية لمناصات المشبك الشريطية في الفئران العادية. النموذج الحالي هو أيضا مناسبة للنماذج التي تسببها الضوضاء والمرتبطة بالعمر cochlear متشابك المشبك. كما تتم مناقشة النتائج النسبية لدراسات الماوس السابقة.

التقييم المورفولوجي والوظيفي لمناصات الشريط في مناطق تردد محددة من القوقعة الماوس

هنا ، نقدم طريقة لتصور استيعاب 3 kDa تكساس الأحمر المسمى dextran في خلايا الشعر السمعية مع قنوات mechanotransduction وظيفية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام dextrans من 3-10 كيلو دا لدراسة الخلايا الانبسية في الشعر والخلايا الداعمة لجهاز كورتي.

Dextran وضع العلامات والشراء في خلايا الشعر الحية والوظيفية Murine Cochlear

الفرخ هو كائن نموذجي فعال من حيث التكلفة ويمكن الوصول إليه ومتاح على نطاق واسع لمجموعة متنوعة من الدراسات. هنا ، يتم تفصيل سلسلة من البروتوكولات لفهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطور الأذن الداخلية للطيور وتجديدها.

في طرق Ovo و Ex Ovo لدراسة تطور الأذن الداخلية للطيور

نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لعزل وزراعة خلايا شعيرات القوقعة الأولية من الفئران. في البداية ، تم تشريح عضو كورتي من قوقعة الفئران حديثي الولادة (الذين تتراوح أعمارهم بين 3-5 أيام) تحت المجهر. بعد ذلك ، تم هضم الخلايا إنزيميا في تعليق خلية واحدة وتحديدها باستخدام التألق المناعي بعد عدة أيام في الثقافة.

عزل وزراعة خلايا شعر القوقعة الأولية من الفئران حديثي الولادة

اكتشف تقنية HPICM لتصوير حزم السtereocilia الحية في خلايا الشعر السمعية بدقة نانومترية دون تلامس. تتيح هذه الطريقة دراسة التغيرات التركيبية الديناميكية لساعات متواصلة.

Stereocilia حزمة التصوير مع قرار نانوية في خلايا الشعر السمعي الثدييات الحية

استكشف المزيد من الفيديوهات