هندسة ومراقبة الدوائر الجينية البصرية المستقرة في خلايا الثدييات بشكل موثوق

تم تصميم البروتوكول البصري الوراثي الموحد للمختبرات المهتمة باستخدام الضوء كحافز للتحكم في الخصائص الخلوية في أنظمة خلايا الثدييات الهندسية. من السهل تنفيذ هذا البروتوكول في المختبرات التي لا تعرف علم البصريات الوراثي ويوفر طرقا للتحكم الزماني المكاني الدقيق في الأنظمة البيولوجية الهندسية. هذه الطريقة لديها مجموعة واسعة من التطبيقات في مجالات بحثية محددة حيث قد تكون المعلومات المكانية الزمانية مهمة بما في ذلك بيولوجيا السرطان وبيولوجيا النظم وتمايز الأنسجة.

بادئ ذي بدء ، حدد المكونات الوراثية لدمجها في دائرة جينية واحدة أو بلازميد. على سبيل المثال ، مواقع تكامل الحمض النووي للثدييات ، أو العناصر المستجيبة للضوء ، أو الجينات الوظيفية. بعد تجميع وفحص جميع الميزات الضرورية مثل كودونات البدء ، والتسلسلات التنظيمية أو المترجمة ، استخدم أي هندسة وراثية وبرامج استنساخ جزيئية ، وقم بالتعليق على تسلسلات الحمض النووي وتخزينها لاستخدامها لاحقا وكمرجع.

التحقق من صحة الاشعال حسابيا لبناء البلازميد من خلال ميزات برنامج الاستنساخ الجزيئي المدمج، على سبيل المثال، محاذاة التسلسل. لتوليد خط خلية مستقر ، قم بنقل الدوائر الجينية المصممة والخلايا المطلوبة باستخدام خليط دهني من الحمض النووي لدائرة الجينات مع المؤتلف المناسب. بعد أن تكون الخلايا متقاربة بنسبة 80 إلى 100٪ ، قم بتجميد الخلايا في مزيج من 45٪ من الوسائط القديمة ، و 45٪ من الوسائط الجديدة ، و 10٪ DMSO.

انقل الخلايا المتبقية إلى أنبوب معقم وقم بإجراء فرز أحادي الخلية لعزل الخلايا وحيدة النسيلة في صفيحة من 96 بئرا. بعد حوالي أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع من الفرز أحادي النسيلة ، يجب أن تحتوي الآبار داخل لوحة البئر المكونة من 96 بئرا على بؤر. عندما يتم تحقيق التقاء 50 إلى 60 ٪ ، قم بتقسيم الخلايا إلى لوحة من 12 بئرا.

أضف البرنامج الثابت إلى دائرة LPA المجمعة باستخدام مبرمج متحكم دقيق. بعد ذلك ، قم بدمج الأجزاء المطبوعة 3D في لوحة الدوائر المجمعة باستخدام لوحة التركيب ، ولوحة الدوائر ، وفاصل LED ، ومحول اللوحة ، ولوحة 24 بئرا ، وغطاء اللوحة ، ومسامير التركيب ، وصواميل الجناح ومكونات التراص. لبدء تجربة بصرية وراثية، استخدم برنامج Iris المتوفر على موقع Tabor Lab على الويب لبرمجة بطاقة SD ل LPA واستكشاف ظروف الإضاءة المناسبة.

بعد ذلك ، أدخل قيم الكثافة مع النسخ المتماثلة التقنية للمخطط التفصيلي التجريبي المطلوب. أضف حوالي 75000 خلية لكل بئر في صفيحة سوداء مكونة من 24 بئرا بحجم إجمالي قدره 500 ميكرولتر ، ثم ضع الخلايا في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ من ثاني أكسيد الكربون للسماح لها بالاستقرار لمدة ساعتين إلى ست ساعات. بعد نقل الخلايا الموجودة في غطاء زراعة الأنسجة في نهاية الحضانة ، قم بإزالة الغطاء البلاستيكي وإضافة شريط رقائق لاصق إلى أعلى اللوحة لتقليل نقل الضوء بين الآبار بحيث لا يمكن للضوء الدخول إلا من خلال LED الموجود في أسفل البئر.

ضع اللوحة في الأجزاء ثلاثية الأبعاد المجهزة من LPA ، ثم قم بتغطية اللوحة بغطاء LPA المطبوع ثلاثي الأبعاد والذي يتناسب مع مسامير الجهاز في كل زاوية. قم بتوصيل الجهاز بمصدر الطاقة واضغط على زر إعادة الضبط على جهاز LPA لضمان تطبيق إعدادات تجربة LPA المحدثة واحتضان الخلايا. بعد الحضانة ، داخل غطاء زراعة الأنسجة ، قم بإزالة شريط الرقائق من اللوحة واترك اللوحة لمدة دقيقة إلى دقيقتين لمنع التكثيف من التشكل على الغطاء البلاستيكي.

بعد ذلك ، ضع الغطاء البلاستيكي الأصلي مرة أخرى على اللوحة وصور الخلايا باستخدام تباين الطور المناسب أو المجهر الفلوري. بعد 24 إلى 72 ساعة بعد الحث ، تليها التربسينات ، قم بنقل محتويات كل بئر بالكامل من حوالي 500 ميكرولتر إلى الأنابيب الموسومة المجهزة بمصفاة الخلايا. ثم باستخدام برنامج أداة قياس التدفق الخلوي المناسب ، قم بإنشاء بوابة تشتت أمامية وجانبية لالتقاط الخلايا المفردة ذات الحجم والدقة المناسبين لاستبعاد الحطام والكتل الخلوية.

بمجرد تعيين البوابة ، التقط ما يقرب من 10،000 خلية باستخدام البوابة المناسبة واضبط رقم الخلية اعتمادا على كمية البيانات الخلوية المطلوبة وكرر التقاط الخلايا التجريبية في كل أنبوب. بعد الحث والتريبسين ، انقل محتويات كل بئر بالكامل تبلغ حوالي 500 ميكرولتر إلى الأنابيب الموسومة. الطرد المركزي للخلايا لمدة خمس دقائق في 400 مرة G.بعد التخلص من supernatant ، انقل العينات إلى غطاء الدخان الكيميائي.

أعد تعليق الخلايا في 750 إلى 1،000 ميكرولتر من 4٪ PFA المخفف في PBS وماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات لكسر كتل الخلايا. بعد 15 دقيقة من الحضانة ، أضف 750 إلى 1000 ميكرولتر من PBS ومرة أخرى ماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات ، ثم قم بتكسير الخلايا لمدة خمس دقائق عند 400 مرة G في درجة حرارة الغرفة. بعد التخلص من السوبرناتانت ، انقل العينات إلى غطاء دخان كيميائي وأعد تعليق الخلايا في 750 إلى 1،000 ميكرولتر من الميثانول البارد المثلج كما هو موضح واسمح للخلايا بالجلوس لمدة 30 دقيقة في ثلاجة 20 درجة مئوية تحت الصفر.

بعد الحضانة ، أضف 750 إلى 1،000 ميكرولتر من PBS أثناء السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات. ثم بعد الطرد المركزي للخلايا لمدة خمس دقائق عند 400 مرة G ، تخلص من المادة الفائقة وانقل العينات إلى غطاء الدخان الكيميائي. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر أو أي تخفيف مناسب آخر للأجسام المضادة الأولية المصنفة وماصة لأعلى ولأسفل من ست إلى ثماني مرات ، ثم احتضنها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، أضف 750 إلى 1،000 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحضانة ومحلول الماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات ، ثم قم بالطرد المركزي للخلايا لمدة خمس دقائق بسرعة 400 مرة G.Next ، وأعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من PBS وكسر الكتل عن طريق السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات. انقل محتويات كل أنبوب بالكامل إلى أنابيب تحمل علامات مع مصافي الخلايا. أحضر الخلايا إلى أدوات قياس التدفق الخلوي المناسبة باستخدام أشعة الليزر ذات الأطوال الموجية الصحيحة.

تم إجراء المعايرة البصرية للأجهزة. باستخدام الصورة المكتسبة ، تم حساب قيم التعويض عن LED ، وتم طرح إشارة الخلفية ، وتم استنتاج كثافة البكسل. وكان معامل التباين ضئيلا بين 96 بئرا.

أظهر برنامج المعايرة تباين LED حسب الموقع وأنشأ تعديلا للمقياس الرمادي بحيث يتم تطبيع كل مؤشر LED بنفس الكثافة. تم تحفيز التعبير الجيني في الخلايا الأخف وزنا المهندسة عبر المجهر الفلوري في فترات نبض الضوء المختلفة على LPA وتم تصوير الخلايا لتعبير Brightfield و GFP. باستخدام قياس التدفق الخلوي ، تم تحفيز الخلايا بقيم مختلفة لطول النبض وأظهرت استجابة جرعة من التعبير الجيني كميا على مستوى السكان بأكثر من أربعة أضعاف التغيير من الحالات غير المستحثة.

حققت ردود الفعل السلبية أكثر من خمسة أضعاف الحد من ضوضاء التعبير الجيني كما هو موضح من خلال مقارنة قيم شدة الضوء المختلفة للنظام الأخف وزنا مقابل الضوء النابض بالحياة أو الضوء. أظهر تحليل qPCR أن الخلايا الأخف وزنا هندسيا عبرت عن مستويات الحمض النووي الريبي بطريقة تستجيب للجرعة مع تحريض يزيد عن عشرة أضعاف من الحالات غير المستحثة ، مما يطابق كمية التدفق الخلوي. أظهرت الدائرة الجينية الأخف وزنا هندسيا كميات متزايدة من الضوء الأزرق الذي أدى إلى زيادة مستويات بروتين KRAS ومستويات ERK المفسفرة.

يمكن إجراء العديد من الفحوصات الوظيفية بما في ذلك النمو أو حركة الخلايا أو التئام الجروح أو الانتشار أو فحوصات الغزو. يمكن أن توفر هذه الطرق رؤى محددة حول آليات بيولوجيا السرطان أو تمايز الأنسجة أو مقاومة الأدوية.