A المقايسة المستندة إلى لوحة لقياس إطلاق مونوامين الذاتية في شرائح الدماغ الحادة

هذه التقنية هي تكييف من الأساليب الشائعة الاستخدام لفحص إطلاق مونوامين، مما يسمح بقياس الإطلاق الذاتية بدلا من مونوامينات محملة مسبقا تحت ظروف دوائية متعددة في وقت واحد. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنها فعالة من حيث التكلفة إلى حد ما ، ويمكن فحص حالات دوائية متعددة في وقت واحد ، ويمكننا دراسة إطلاق مونوامين داخلي مع القدرة على التمييز بين إطلاق المركبات والنقل بوساطة. لإعداد شرائح الدماغ من البالغين 250 إلى 350 غرام الفئران الذكور بعد الحصاد، وضعت على الفور الدماغ والجليد الباردة الأوكسجين تشريح العازلة، والحصول على 300 ميكرون أقسام الدماغ التاجي من كل منطقة من المناطق ذات الاهتمام.

لمزيد من تشريح شرائح الدماغ ، قم بتحريك الأنسجة بعناية إلى الشرائح الزجاجية واستخدم أطلس دماغ الفئران لتحديد المخطط الظهري استنادا إلى بنيته المخططة الداكنة ، وتحديد قرن آمون استنادا إلى قربه من القشرة وبنيته الحلزونية الفريدة. فصل نصفي الكرة الأرضية الأيمن والأيسار لاستخدامها كشرائح التحكم والتجريبية. يمكن تشريح المخطط الظهري إلى لكمتين ملليمترتين.

ثم استخدم ماصة نقل البلاستيك مع طرف معدل لنقل العينات إلى حاويات صغيرة مغمورة في عازلة تشريح الجليد البارد المؤكسيج مع فقاعات الأكسجين. للحث على إطلاق مونوامين، نقل عينات الأنسجة إلى كل بئر من العرف جعل 48 غرفة إيفلوكس جيدا تحتوي على 0.5 إلى ملليلتر واحد من العازلة efflux لكل بئر مع محتدما لطيف مستمر والسماح للعينات لاسترداد لمدة 30 إلى 50 دقيقة في 37 درجة مئوية. في نهاية فترة التوازن، قم بتحريك حامل الأنسجة مع أنسجة الدماغ إلى الآبار التي تحتوي على 500 ميكرولتر من عازل اللوكس المؤكسيج مع أو بدون عامل دوائي، والتنصت على حامل على حافة البئر لمنع الحد الأدنى من نقل العازلة بين الآبار لاحتضان 20 دقيقة في 37 درجة مئوية.

في نهاية الحضانة ، قم بنقل الحامل إلى مجموعة جديدة من الآبار تحتوي على 500 ميكرولتر من العازلة efflux مع أو بدون الدواء المثير للاهتمام وإعادة الطبق إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة 20 دقيقة إضافية. خلال الحضانة الثانية نقل المحلول من الآبار من الحضانة الأولى إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق التي تحتوي على 50 ميكرولتر من حمض بيركلوريك أو فوسفوريك عادي واحد على الجليد، وتسمية الأنابيب رقم واحد "في نهاية الحضانة الثانية، نقل حامل الأنسجة إلى آبار فارغة مع لوحة على الجليد ونقل الناسخات من الحضانة الثانية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق الجديدة التي تحتوي على 50 ميكرولتر من واحد بيركلوريك العادي أو الفوسفوري حمض على الجليد. تسمية هذه الأنابيب رقم اثنين "عندما تم نقل جميع المضادات، إضافة ملليلتر واحد من الجليد البارد تشريح العازلة إلى كل بئر من الأنسجة واستخدام ملاقط صغيرة لنقل كل عينة من الأنسجة إلى أنبوب جديد microcentrifuge.

قم بإزالة العازلة من أنابيب العينة وتخزين الأنسجة عند ناقص 80 درجة مئوية، ثم نقل حلول الحضانة التي تم جمعها إلى أنابيب فلتر الطرد المركزي للطرد المركزي ووضع الخيوط على الجليد حتى تحليل HPLC. تعيين إمكانات النماء المبكر ومعدل التدفق إلى توصية الشركة المصنعة للكشف عن مونوامينات. تحميل و aliquot المناسبة من كل عينة، بما في ذلك معايير الارسال العصبي في HPLC للحقن التلقائي والكشف والسماح للأداة لإكمال التحليل.

ثم استخدم برنامج تحليل HPLC للحصول على بيانات الكروماتوغراف وتحليلها باستخدام منحنى قياسي يتكون من كل أحادي الأمين للحصول على المنطقة تحت المنحنى استنادا إلى إرشادات الشركة المصنعة. بعد ست ساعات من التحليل الوظيفي، تظل عينات الأنسجة قابلة للتطبيق، في حين أن العينات المحتضنة بنسبة 1٪ تريتون X-100 تظهر انخفاضا كبيرا في تحويل MTT. العلاج الحاد لمدة 20 دقيقة من أقسام الدماغ فرس النهر والقشرة الجبهية مع الأمفيتامين يحفز زيادة كبيرة في مستوى خارج الخلية من كل مونوامين.

عندما يتم معالجة العينات مسبقا مع فلوكستين, مثبط إعادة امتصاص السيروتونين انتقائية, زيادة الأمفيتامين الناجمة في السيروتونين خارج الخلية داخل قرن آمون والقشرة الجبهية لا يحدث, في حين أن الزيادة في إنتاج الدوبامين خارج الخلية والنورادرينالين لا تتأثر. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العلاج الحاد لمدة 20 دقيقة من اللكمات المخطط الظهري مع الأمفيتامين يحفز على زيادة 35 ضعفا في التعبير عن مستوى الدوبامين خارج الخلية ، في حين أن علاج لكمة المخطط الظهري مع الكوكايين ، وهو مانع نقل أحادي الأمين ، يؤدي إلى تثبيط كبير للدوبامين خارج الخلية الناجم عن الأمفيتامين. زيادة تركيز كلوريد البوتاسيوم خارج الخلية لاستحضار إزالة الاستقطاب الغشاء يكفي للحث على إطلاق الإكسوسيتوتيك من مونوامين بالمقارنة مع ظروف السيطرة غير المعالجة، ولا فلوكستين ولا علاج الكوكايين يمنع هذه الزيادة المستحثة الاستقطاب العميق.

من الضروري أن يكون هناك أقسام قطع نظيفة ، وتوطين دقيق لللكمات ، والحفاظ على الأكسجين المستمر طوال التجربة. يمكن استخدام أقسام الدماغ بعد التجارب لمزيد من المعالجة والتحليل الكيميائي الحيوي ، مثل النشاف الغربي والأنسجة.