في التصوير الحي لأنسجة الدماغ النشطة بالكامل في يرقات حمار وحشي مستيقظا والأحداث عن طريق إزالة الجمجمة والجلد

تسمح هذه الطريقة بتصور دماغ زيبرافيش في مراحل اليرقات اللاحقة للسماح بمراقبة العمارة العصبية بطريقة مفصلة للغاية في الجسم الحي لم تكن ممكنة من قبل. الخلايا الصباغية ، التي ظهرت خلال تطور اليرقات في وقت لاحق وتمنع الدماغ من التصوير الواضح ، ليست مشكلة مع هذه الطريقة لأنها ببساطة تتم إزالتها. مع هذه الطريقة ، يجب أن يكون من الممكن دراسة العمليات التي تحدث في مراحل لاحقة أثناء تطور اليرقات في الدماغ ، والعمليات التي تؤثر على اللدونة المتشابكة ، أو انحطاط الخلايا العصبية أو تجديدها.

قبل البدء في التجربة استخدام سحب micropipette لإعداد حادة، رقيقة، والإبر الزجاجية من الشعيرات الدموية الزجاج. بعد ذلك ، استخدم ماصة باستور بلاستيكية لجمع اليرقات في طبق بيتري قطره 90 ملليمترا يحتوي على الحل المناسب. نقل اليرقة المختارة إلى طبق بيتري قطره 35 ملليمترا يحتوي على ACSF ووضع غطاء زجاجي 24 في 24 ملليمترا ومربعا وزجاجا في غطاء طبق بيتري.

ثم aliquot حجم ACSF اللازمة للتجربة في phial المناسبة للأوكسجين مع كاربوجين. لتضمين اليرقة ، استخدم ماصة باستور لنقل اليرقة المخدرة إلى غرفة متصاعدة تحت منظار مجسم. إذا كانت أي يرقة لا تزال قادرة على التحرك ، فلا تستخدم السمك للتجربة حتى تكون الأسماك غير قادرة تماما على الحركة.

عندما تكون اليرقة غير متحركة ، قم بإزالة الوسط الزائد بعناية وأضف على الفور ملليلتر واحد على الأقل من الآغروز المنخفض الذائب على اليرقة. توجيه حمار وحشي مع المنطقة الظهرية التي تواجه أقرب إلى سطح الآغاروز ممكن. إذا تم تصوير اليرقة باستخدام مجهر مقلوب ، بعد الترسخ ، قم بتقليم الآغاروز الذي يحتوي على اليرقة إلى كتلة صغيرة من التكعيب.

لفضح الدماغ للتصوير، تقليم بعيدا agarose الزائدة على منطقة الدماغ من الفائدة حسب الضرورة واستخدام إبرة زجاجية لإجراء شق صغير من خلال الجلد بالقرب من، ولكن ليس أكثر، المنطقة ذات الأهمية دون اختراق عميق جدا في الأنسجة. بالكاد تتحرك الإبرة فقط تحت سطح الجلد، والاستمرار في إجراء تخفيضات صغيرة جدا بعناية في جميع أنحاء المنطقة ذات الاهتمام حتى الجلد على المنطقة من الفائدة يمكن إزالتها أو دفعها جانبا. عندما تتم إزالة الأنسجة من جميع الأجنة، إضافة قطرة صغيرة من agarose ذوبان منخفضة إلى غرفة التصوير المعدة سابقا من المجهر المقلوب واستخدام ملعقة صغيرة لقلب كتلة agarose التكعيبية 180 درجة على قطرة agarose في غرفة التصوير.

عندما تتوطد الآغروز ، املأ غرفة التصوير ب ACSF الطازجة وابدأ تصوير اليرقة. هنا ، يمكن ملاحظة يرقة معدلة وراثيا سليمة بعد 14 يوما من الإخصاب مع الجمجمة لا تزال سليمة. كما هو مبين، يتم توزيع الخلايا الصباغية داخل الجلد المتراكب في جميع أنحاء الرأس، مما يتعارض مع إشارة الفلورسنت في المنطقة ذات الاهتمام.

بعد جراحة الجمجمة المفتوحة ، تصبح منطقة الاهتمام متاحة بحرية للتصوير التفصيلي عالي الدقة. الجلد والجمجمة ، أو حاجز الدم في الدماغ أيضا عرقلة اختراق المواد في الدماغ ، كما يتضح من صبغة نووية قوية تلطيخ لوحظ في هذه الخلايا الدماغية إلا بعد جراحة الجمجمة المفتوحة. ويلاحظ أيضا هذه المزايا في 30 يوما بعد الإخصاب.

في الأسماك المعدلة وراثيا التي تحتوي على الأوعية الدموية في الدماغ الفلورية بسبب التعبير عن البروتين الفلوري الأحمر، mCherry، في الخلايا البطانية، ترميز اللون في قيم عمق كومة الصورة يدل على أنه حتى الأوعية الدموية مدفونة بعمق داخل الدماغ إلى ما يقرب من 250 ميكرون لا تزال مرئية بوضوح ويمكن تتبعها. عند إجراء هذا الإجراء نضع في اعتبارنا دائما أن هذه هي عملية جراحية في حي. لذلك، فإنه يتطلب الاحترام والعقل المركز.

بعد هذا الإجراء ، يمكن تسجيل مورفولوجيا الخلايا العصبية ، بما في ذلك الهياكل المتشابكة وأحداث النقل الفسيولوجية وداخل الخلايا في اليرقات التي يزيد عمرها عن سبعة أيام بعد الإخصاب. مع هذه التقنية ، نأمل في توفير نهج يسمح بدراسة العمليات الخلوية أيضا في الدماغ التي تحدث في مراحل اليرقات اللاحقة ، والتي تشارك في إنشاء ، على سبيل المثال ، سلوكيات معقدة مثل السلوك الاجتماعي أو صنع القرار.