في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي من الماوس Geniculate استجابات الخلايا العصبية العقدية لتذوق المحفزات

هنا نقدم كيفية فضح العقدة geniculate من حية، مخدر الماوس المختبر وكيفية استخدام التصوير الكالسيوم لقياس استجابات مجموعات من هذه الخلايا العصبية لتذوق المحفزات، مما يسمح لتجارب متعددة مع المنشطات المختلفة. وهذا يسمح لمقارنات متعمقة من الخلايا العصبية التي تستجيب التي التي tastants.

هذه التقنية يمكن الإجابة على الأسئلة الوظيفية الهامة حول استجابات الخلايا العصبية لتذوق في العقدة geniculate, جزء حاسم من المسار الذوق وترا tympani الداخلية. يمكن استخدام هذه التقنية لمراقبة ردود الفعل في الوقت الحقيقي لعدة خلايا عصبية فردية في تجربة تجريبية واحدة ، حيث أن الخلايا المسجلة لكل أعلى بكثير مما لوحظ عادة عن طريق الطريقة الكهربية. مع الماوس المثبت على الرأس في وضع السطخ على وسادة التدفئة ، قم بإجراء شق منتصف الخط سنتيمترين في الجلد فوق الحلق ، من القص إلى الذقن.

وتراجع الجلد والغدد شبه الفكية لفضح العضلات digastric تماما. بعد تحديد موقع التماس في العضلات paratracheal، فصل التماس مع تشريح حادة وسحب الأنسجة لفتحه. قطع بعناية فتحة في الجزء العلوي من القصبة الهوائية كبيرة بما يكفي لتناسب قطعة من أنابيب البولي ايثيلين دون قطع أكثر من منتصف الطريق من خلال قطر القصبة الهوائية وإدراج أنابيب في القصبة الهوائية نحو الرئتين.

إعادة وضع الرافضات للافراج عن العضلات paratracheal والتراجع عن الغدد الفكية الفرعية. ثم، استخدم كمية صغيرة من الغراء البيطري لختم العضلات paratracheal معا على الأنبوب. لكسر فتح بولا التيمبية، ندف بلطف العضلات digastric المطلوب صعودا وسحب النسيج الضام وبصرف النظر.

إجراء شق في الطرف الأمامي من العضلات، وتجنب الأوعية الدموية. وانسحب للخلف حتى تصبح واضحة من الثيران التيمبية إمالة الرأس إلى الوراء قليلا لرفع بولا التيمبية وتحديد فرع الشريان السباتي الأمامي إلى نقطة الإدراج الخلفي للعضلات digastric.

بالبات فقط الخلفي لهذا الأوعية الدموية لهيكل محدب من بولا التيمبية وتحديد موقع التماس في العضلات. باستخدام مجموعتين من ملقط ناعم، تشريح حادة في التماس حتى عظم بولا التيمبية مرئية واستخدام الجرافات للحفاظ على رؤية واضحة للعظم. تحديد موقع التماس تشغيل الأمامي إلى الخلفي على بولا واستخدام مسبار جراحي لكزة ثقب في العظام في وسط التماس، ثم، واستخدام مجموعة من مقص نهاية غرامة لقطع منطقة دائرية في العظام، مع الحرص على عدم قطع الأوعية الدموية الأمامي والخلفي إلى أو تحت الثور.

لكشف geniculate، حدد موقع القوقعة. الأمامي إلى القوقعة هو عضلة التيماني الشد. استخدام مقص الربيع لقطع وإزالة هذه العضلات.

استخدام التحقيق الجراحي لكزة ثقب في الرعن cochlear واستخدام الشفط فورا لتنشق أي السائل الذي يتدفق من الحفرة. تكبير الثقب في القوقعة ، مع الحرص على عدم تلف الأوعية الدموية التي تحيط القوقعة ، إلى الحافة الخلفية والظريلية. وإمالة رأس الفأر إلى الأمام لتحديد موقع ثقب في العظام الزمنية تحت هيكل القوقعة السابقة.

يحيط علما من الحافة الأمامية إلى الحفرة التي تقع مباشرة على العصب السابع. وأدخل مسبار جراحي في الحفرة للسماح برفع العظم الصدغي بعناية لفضح العصب السابع. إذا لم تكن geniculate مرئية تماما ، قم بإمالة رأس الحيوان بلطف إلى الخلف وحاول سحب الجزء الأمامي من العظام إلى العصب.

إذا كانت العقدة لا تزال غامضة، وسحب ما يصل المزيد من العظام من تحت، مع الحرص على عدم وضع التحقيق العميق تحت العظام، لأن هذا قد يضر geniculate. لتشغيل لوحة التسطان، استخدم الشفط لإزالة السائل من فوق geniculate ووضع الماوس على لوحة ماصة تحت المجهر تشريح. استخدم الثقب المتبقي في الثيران، والثقب في العظم الصدغي، والعصب السابع لتحديد موقع العقدة الجينية.

واستخدام فلتر FITCGFP على نطاق epifluorescent للتحقق من GCaMP الفردية التي تعبر عن الخلايا العصبية العقدة geniculate. ضع إبرة الاستغناء عن خط واحد من التسح بقوة في فم الحيوان ووضع طبق بيتري تحت الفم للقبض على أي سائل. مزامنة بداية تسجيل الفيديو مع بداية العرض التقديمي tastant، ومشاهدة البث المباشر للاستجابات والانجراف، وتسرب أثناء التسجيل.

إذا حدث تسرب، شفط السائل حتى عرض geniculate واضحة وإعادة تسليم التستان. إذا حدث الانجراف، تحقق من أن جميع أجزاء الرأس يتم تشديدها بشدة. إذا لم تحدث استجابة، تحقق من أن السائل يتدفق وأن المجهر والكاميرا يركزان على الموقع المناسب دون أي شيء يحجب مجال الرؤية.

عند الانتهاء من جميع التجارب المطلوبة، تخفيف بلطف الواجهات وتكرار التعرض وتحليل تذوق على الجانب الآخر من الحيوان. كما لوحظ، ومحفزات الذوق المطبقة على اللسان ينبغي أن يؤدي إلى زيادة عابرة سريعة في مضان GCaMP، مما تسبب في تغيير ملحوظ في السطوع بين الخلايا العصبية المستجيبة. يسمح تحليل لقطات الفيديو الفلورية بتوليد آثار تتوافق مع التغيرات في الفلورسينس على الاستجابة الأساسية داخل المناطق الفردية ذات الاهتمام بمرور الوقت.

وتعتبر التغيرات في كثافة الفلورسينس فوق مستوى العتبة استجابة إيجابية. بالإضافة إلى إتلاف العقدة ، من المهم تجنب النزيف. في حالة حدوث نزيف، انتظر حتى يتخثر الدم قبل وضع المحلول الملحي والشفط لإزالة الدم من المجال البصري.

وقد سمح تصور العقدة geniculate الباحثين لقياس مباشرة استجابات الخلايا العصبية لتذوق مثل المحفزات وتحديد هذه الخلايا العصبية مع أدوات مثل GCaMP تعتمد على كري.