تصور وقياس الأضرار التي لحقت بالحمض النووي الخاصة بالموقع القائم على الإندونوكليز
August 21st, 2021
تقدم هذه المقالة الخطوات الأساسية لتثبيط المناعة والكروماتين المناعي. وتستخدم هذه البروتوكولات عادة لدراسة العمليات الخلوية المرتبطة بتلف الحمض النووي ولتصور وقياس تجنيد البروتينات المتورطة في إصلاح الحمض النووي.
يقدم هذا الفيديو المنهجية الخطوات الحاسمة لبروتوكولات التنسيب المناعي والكروماتين المناعي المستخدمة بانتظام لدراسة العملية الخلوية المرتبطة بتلف الحمض النووي وتصور وتحديد كمية توظيف البروتينات المتورطة في إصلاح الحمض النووي. توفر هذه التقنية أدوات قوية للباحثين لتحديد البروتينات الجديدة المرتبطة بالمجراد الجينومي التالف ، بالإضافة إلى تعديلاتها بعد الترجمة اللازمة للتنظيم الدقيق أثناء إصلاح الحمض النووي. وبما أنه يمكن تطبيق هذه التقنيات لدراسة العمليات الخلوية المختلفة، فإن لها صلة محتملة إذا تم استخدام أنظمة ليزر ميكرويررايدييشن أو الحمض النووي القائم على النواة.
في الآونة الأخيرة ، تم تطوير العديد من الأدوات القوية للحث على تلف الحمض النووي الخاص بالموقع الذي يمكن استخدامه لتوسيع فهمنا لإصلاح الحمض النووي. تطبيق النهج الكيميائية الحيوية والجينية، وهذه الأواني ضرورية في الكشف عن الأحداث الخلوية المرتبطة تجنيد وتجميع مجمعات إصلاح الحمض النووي في موقع تلف الحمض النووي. وعلاوة على ذلك، تسمح هذه التقنيات لدراسة هذه العمليات في قرار خلية واحدة باستخدام كل من الخلايا الثابتة والحية.
الحفاظ على خلايا U2OS في monolayers في DMEM ثقافة المتوسطة تكملها 10٪ مصل العجل الجنيني، 2 الجلوتامين ملليمولار، والحل المضاد للمضادات الحيوية 1٪. تنمو الخلايا في بيئة رطبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون في 37 درجة حتى يتم تحقيق التقاء 80٪، وتجديد المتوسطة كل يومين إلى ثلاثة أيام. يستنشق المتوسط ويغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني.
فصل الخلايا مع حل تريبسين-EDTA. عندما تنفصل الخلايا، أوقف نشاط التريبسين بإضافة وسائط الثقافة إلى الخلايا، مما يؤدي إلى تعليق الخلية. عد الخلايا باستخدام غرفة عد الخلايا.
لوحة 20، 000 خلية لكل ملليلتر لكل بئر على لوحة 24 جيدا مع العقيمة 12 ملليمتر انزلاقات الغطاء المستدير في كل بئر. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة في 37 درجة في بيئة ثاني أكسيد الكربون 5٪ الرطبة للسماح المرفق على زلات الغطاء. علاج الخلايا مع 10 نانوغرام لكل النيوكارزينوستاتين ملليلتر أو استخدام الطريقة المناسبة للحث على فواصل حبلا مزدوجة عن طريق النظم القائمة على الاندونوكلوز.
احتضان الخلايا لمدة ساعة إلى ثماني ساعات في 37 درجة في بيئة ثاني أكسيد الكربون 5٪ الرطبة لمتابعة الحركية لإصلاح الحمض النووي. إصلاح الخلايا مع 4٪ حل برنامج تلفزيوني الفورمالديهايد لمدة 20 دقيقة في 25 درجة. إزالة حل تحديد وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق لكل منهما.
إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 0.2٪ تريتون X حلها في برنامج تلفزيوني. احتضان العينات لمدة 20 دقيقة. غسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
منع ملزمة غير محددة مع 5٪ BSA المخفف في BSA-PBST واحتضان العينات لمدة 20 دقيقة على الأقل. إضافة الكمية المناسبة من الأجسام المضادة الأولية المخففة في 1٪ BSA-PBST الحل. ضع كل غطاء ينزلق رأسا على عقب على بارا فيلم أو 10 قطرة ميكرولتر من الجسم المضاد المخفف.
احتضان العينات في غرفة الرطوبة لمدة ساعة ونصف الساعة في أربع درجات. وضع الغطاء ينزلق مرة أخرى يجري الجانب حتى في لوحة 24 جيدا وغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. إضافة الكمية المناسبة من الأجسام المضادة الثانوية المخففة في 1٪ BSA-PBST.
ضع كل غطاء ينزلق رأسا على عقب على parafilm على قطرة 10 ميكرولتر من الجسم المضاد المخفف. احتضان العينات في غرفة الرطوبة في أربع درجات لمدة ساعة. ضع الغطاء ينزلق مرة أخرى يجري إعدادها في لوحة 24 جيدا وغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
قبل إزالة آخر حل الغسيل PBS، تأخذ بلطف من زلات الغطاء مع نصف ملاقط وإبرة، ومن ثم وضعها رأسا على عقب على الشرائح الزجاجية مع قطرات من المتوسطة المتصاعدة. الكروماتين المناعي هو تقنية تستخدم على نطاق واسع لتحديد أنماط ملزمة من البروتينات للحمض النووي. للكشف عن إشغال بروتين إصلاح الرغبة حول DSB ، يتم استخدام جهاز مضاد محدد لprecipitate البروتين المهم من إعداد الكروماتين جنبا إلى جنب مع منطقة الحمض النووي التي يرتبط بها.
وعلاوة على ذلك، يطبق برنامج التحمل المشترك عادة لرسم خريطة لوجود تعديل محدد بعد الترجمة في استخدامه من قبل هيئات خدمة المركبات في مكان معين من الجراد الجينومي. وينبغي استزراع ما يقرب من 20 مليون خلية لكل ملليلتر في طبق طوله 15 سنتيمترا لكل عينة. إزالة الثقافة المتوسطة وغسل الخلايا مرتين مع الجليد البارد PBS.
إصلاح الخلايا مع 1٪ حل الفورمالديهايد-برنامج تلفزيوني. ضع اللوحة على شاكر مداري واهيج بلطف لمدة 20 دقيقة. وقف التثبيت مع الجليسين للوصول إلى تركيز النهائي من 125 ملليمولار واحتضان على شاكر المداري مع التحريض لطيف لمدة خمس دقائق في 25 درجة.
ضع الطبق على الجليد واغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني بارد الجليد. كشط الخلايا في الجليد البارد PBS ونقلها إلى أنابيب مخروطية 15 ملليلتر. طرد الخلايا في 5000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق في أربع درجات.
يستنشق بعناية supernatant وإعادة إنفاق بيليه في اثنين من تحلل الخلية ملليلتر العازلة واحتضان على الجليد لمدة 10 دقائق. جهاز طرد مركزي عند 5,000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق بأربع درجات. تجاهل بعناية supernatant وإعادة إنفاق بيليه في 500 إلى 1، 500 ميكرولتر تحلل النووية العازلة واحتضان على الجليد لمدة 30 إلى 60 دقيقة.
نقل الليسترات إلى أنبوب البوليسترين المخروطية مناسبة ل sonication. Sonicate lysate لقص الحمض النووي إلى متوسط حجم جزء من 300 إلى 1000 أزواج قاعدة. إعداد Dynabeads لخطوات ما قبل التنظيف والمناعة.
غسل الخرز مرتين لمدة 10 دقائق في أربع درجات مع العازلة RIPA. Resuspend Dynabeads في نفس حجم المخزن المؤقت RIPA كما كنت أخذت من حل المخزون الأصلي في الخطوات 3.1. مسح مسبق 25 إلى 30 ميكروجرام كروماتين من كل عينة مع أربعة حبات ديناباز ميكروليتر عن طريق التناوب لمدة ساعة إلى ساعتين في أربع درجات.
عجل Dynabeads مع المغناطيس ونقل supernatant إلى أنبوب Eppendorf جديدة. إضافة كمية مناسبة من الأجسام المضادة لكل عينة الكروماتين وتدوير بين عشية وضحاها في أربع درجات. في اليوم التالي، أضف 40 ميكرولتر من حبات الدينابيد المغسولة إلى كل عينة واحتضانها بين عشية وضحاها بالتناوب في أربع درجات.
يغسل مرة واحدة مع 300 ميكرولتر منخفض الملح العازلة لمدة 10 دقائق مع دوران في أربع درجات. يغسل مرة واحدة مع 300 ميكرولتر عالية الملح العازلة لمدة 10 دقائق مع التناوب في أربع درجات. يغسل مرة واحدة مع 300 ميكرولتر كلوريد الليثيوم العازلة لمدة 10 دقائق مع التناوب في أربع درجات.
اغسل مرتين مع 300 ميكرولتر TE لمدة 10 دقائق مع دوران للغسيل الأول في أربع درجات والغسيل الثاني عند 25 درجة. إضافة 200 ميكرولتر elution العازلة إلى الخرز واحتضانها في 65 درجة في الحرارة شاكر لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز مستمر. نقل supernatant إلى أنبوب جديد والخرز elute مرة أخرى في 200 ميكرولتر elution العازلة.
إضافة 500 ميكروغرام لكل بروتين المليلتر-K ونصف في المئة SDS واحتضان العينات في 50 درجة لمدة ساعتين. تنفيذ استخراج الكلوروفورم ونقل المرحلة المائية العليا إلى أنبوب Eppendorf جديدة. إضافة حجمين ونصف من الإيثانول المطلق و 0.1 المجلد الثالث خلات الصوديوم المول خلات 5.2.
احتضان لمدة 20 دقيقة على الأقل في ناقص 80 درجة. إزالة الإيثانول والهواء الجاف بيليه. Resuspend بيليه في 50 ميكرولتر TE. لدراسة توزيعها الخاص على الحمض النووي ، يجب تطبيق الاختصاص المناعي للكروماتين.
يتم عرض نتائج تجريبية نموذجية حصل عليها ChIP-qPCR في هذا الرقم ، مما يدل على الإثراء الزمني لغاز غاما الهستون AX كرد على تلف الحمض النووي المستحث الناجم عن I-PpoI. في الجزء الأيسر من الصورة، تظهر إشارة جاما هيستون AX المكتشفة في الوقت المناسب في جانب الكسر، بينما في الجزء الأيمن، يتم تقديم توزيع جاما لهستون AX في منطقة جين التحكم التي لم يتم فيها حدوث فواصل موضحة. على الرغم من أن إصلاح الحمض النووي هو مجال بحثي حديث نسبيا ، إلا أن معرفتنا تتزايد بسرعة بمساعدة كل من الأساليب الكيميائية الحيوية والمجهرية.
ومع ذلك، تتطلب التقنيات الكيميائية الحيوية، مثل البقعة الغربية، وسرعة المناعة، وقياس الطيف الكتلي كمية كبيرة من الخلايا. تمثل عمليات إصلاح الدراسة لقطة من مجموعة الخلايا المرغوبة. وقد أحدث المجال المجهري ثورة في التقنيات عالية الدقة، مثل المجهر فائق الدقة، الذي يسمح بتصور العمليات الخلوية الناجمة عن تلف الحمض النووي على المستوى النووي، فضلا عن ضمان رسم خرائط دقيقة لتوطين البروتين المشترك.
من ناحية أخرى ، فإن التكفير المناعي للكروماتين هو أداة قوية ، خاصة من خلال الجمع بينه وبين طرق التسلسل لتصور نمط الربط على نطاق الجينوم للبروتينات ذات الصلة بإصلاح الحمض النووي المطلوب وفواصل حبلا مزدوجة في مناطق الكروماتين أو هيتيركروماتين.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تصف هذه المقالة البروتوكولات المهمة للتلطيخ المناعي وتفاعل الترسيب المناعي للكروماتين، والتي تعتبر ضرورية لدراسة العمليات الخلوية المتعلقة بتلف الحمض النووي. تمكن هذه المنهجيات الباحثين من تصور وكمّية تجنيد البروتينات المشاركة في آليات إصلاح الحمض النووي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال البحث
- استجابة تلف الحمض النووي
- آليات الإصلاح الخلوية
- تصور تجنيد البروتينات
الخلفية
- تعتبر دراسة تلف الحمض النووي وإصلاحه ضرورية لفهم صحة الخلايا.
- التقنيات مثل التلطيخ المناعي و ChIP ضرورية لفحص تفاعلات البروتينات مع الحمض النووي التالف.
- تسمح التطورات الحديثة بخصوصية محسنة في تحفيز تلف الحمض النووي.
الطرق المستخدمة
- التلطيخ المناعي لتصور البروتينات
- تفاعل الترسيب المناعي للكروماتين لتحديد تفاعلات البروتين-الحمض النووي
- استخدام خطوط الخلايا مثل U2OS للإجراءات التجريبية
النتائج الرئيسية
- تصور ناجح لبروتينات الإصلاح في مواقع تلف الحمض النووي
- تقييم كمي لديناميكيات تجنيد البروتينات
- تحديد التعديلات ما بعد الترجمة للبروتينات المرتبطة بالحمض النووي التالف
الاستنتاجات
- توضح الدراسة فعالية التلطيخ المناعي و ChIP في توضيح آليات إصلاح الحمض النووي.
- هذه التقنيات لا تقدر بثمن للتقدم في البحوث في البيولوجيا الجزيئية والاستجابات الخلوية لتلف الحمض النووي.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Precise visualization and quantification of site-specific DNA damage responses are critical for de-risking early discovery programs targeting genome maintenance pathways. The integration of endonuclease-based DNA damage induction with immunostaining and chromatin immunoprecipitation (ChIP) enables robust target validation and mechanistic insight into DNA repair factor recruitment. These capabilities support predictive confidence at key inflection points in oncology and genome stability portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of DNA repair pathway activation and protein recruitment at defined genomic loci.
- Supports functional target validation by quantifying repair factor occupancy and post-translational modifications.
- Facilitates mechanistic de-risking for candidate targets involved in genome integrity.
- Provides evidence for pathway engagement and biological relevance in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Establishes validated cellular systems for downstream screening of DNA repair modulators.
- Delivers reproducible, quantitative readouts of protein localization and chromatin binding.
- Enables assay standardization for high-content imaging and ChIP-based platforms.
- Supports reliable evaluation of compound effects on DNA repair dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns DNA repair factor dynamics with translational biomarker strategies when supported by genomic occupancy data.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of DNA repair targets.
- Informs risk-adjusted advancement decisions for genome maintenance therapeutics.
- Offers predictive de-risking for candidate interventions in DNA damage response pathways.
Pipeline & Workflow Integration
This methodology bridges early discovery, target validation, and preclinical research by enabling quantitative analysis of DNA repair protein dynamics at site-specific lesions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing repair complex assembly at induced DNA breaks.
- Screening: Provides assay-ready systems with reproducible, quantitative outputs for compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative measurements of protein occupancy and post-translational modifications at defined genomic regions.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to biomarker development and preclinical validation when supported by occupancy data.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for interrogating diverse DNA repair targets and pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in DNA repair target validation.
- Operational Value: Standardizes workflows for reproducibility and scalability across research teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of genome maintenance programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, immunostaining, and ChIP protocols.
- Demands access to high-resolution microscopy and quantitative PCR or sequencing infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible data generation and interpretation.
- Adaptation may be needed for different cell types or DNA damage induction systems.
- Sample throughput and cell number requirements may limit scalability for some applications.
