القياسات القائمة على الفلورسينس من فوسفاتيديلسيرين / فوسفاتيديلينوزيتول 4-تبادل الفوسفات بين الأغشية

تستخدم هذه الطريقة الفلورسينس لتحديد ما إذا كان نقل البروتين إلى liqids المهم بيولوجيا بين الغشاء الاصطناعي وبالتالي المساهمة في توزيع هذه الدهون داخل الخلايا eukaryotic. هذه التقنية يجعل من الممكن لاستخراج ونقل الدهون الطبيعية عن طريق البروتين، فإنه يتطلب والخلايا الفلورية والدهون التي هي سهلة لجعل. يمكن استخدام هذه الطريقة وتعديلها للحصول على نظرة ثاقبة في البيولوجيا الخلوية عن طريق البروتينات وراء توزيع بعض الدهون الأساسية بين الجهاز والأغشية.

تعتبر المظاهرة البصرية حاسمة لشرح كيفية إجراء قياسات في الوقت الحقيقي لنقل الدهون عن طريق الفلورسينس. لذا فإن إظهار الإجراء سيكون أيضا مود مجديلين، مهندسة في مختبري. تبدأ بإعداد الطازجة المصفاة وإزالة الغاز HEPES خلات البوتاسيوم العازلة، تكملها مع كلوريد المغنيسيوم ميليمولار واحد لتشكيل المخزن المؤقت HKM.

ثم، وإعداد الليبوسومات مصنوعة فقط من جهاز الكمبيوتر أو مخدر بالإضافة إلى ذلك مع اثنين من الضرس في المئة PS أو PI(4)P. الآن، ضع القارورة على المبخر الدوار لتجفيف الدهون تحت الفراغ. في بئر واحد، مزيج الليبوسومات التي تحتوي على اثنين من الضرس في المئة PS مع استشعار الدهون، NBD-C2 لاكت، إلى تركيز نهائي من 250 نانومولار وحجم 100 ميكرولتر.

ملء بئر ثانية مع نفس الكمية من الدهون و NBD-C2 لاكت مختلطة مع ثلاثة بروتين نقل الدهون ميكرومولار أو LTP. ملء بئر ثالثة مع 250 نانومولار NBD-C2 lact مختلطة مع نقية 80 ميكرومولار PC liposomes وبئر رابع مع نقية 80 ميكرومولار ليبوسومات PC. كرر هذه الخطوات لإعداد ثلاثة سلاسل إضافية من أربعة آبار.

ثم ضع لوحة متعددة الآبار في القارئ الفلوري. لكل سجل جيد طيف NBD من 505 إلى 650 نانومتر مع عرض النطاق الترددي خمسة نانومتر عند الإثارة في 490 نانومتر في 25 درجة مئوية. لكل سلسلة طرح الطيف المسجل مع الليبوسومات فقط من الأطياف الأخرى.

ل PI(4)P استخراج المقايسة إعداد الليبوسومات مخدر مع اثنين من المولر في المئة فوسفاتيدلينوزيتول-4-الفوسفات وإجراء القياسات مع التحقيق NBD-PH FAPP. إجراء تجارب التحكم وتحديد نسبة الاستخراج. بعد الانتهاء من الليبوسومات الطاردة ملء أنبوب مع هذه الليبوسومات مقذوف.

إعداد خالية من الغاز الطازجة وتصفيتها HKM العازلة والحفاظ على الأنابيب التي تحتوي على الليبوسومات مقذوف في درجة حرارة الغرفة. التفاف أنابيب تحتوي على الليبوسومات مع رودامين المسمى فوسفاتيديليثانولامين في رقائق الألومنيوم وتخزينها في مربع مبهمة لمنع أي تبييض الصورة. تعيين درجة الحرارة بين 25 و 37 درجة مئوية وضبط أحادية اللون الإثارة إلى 460 نانومتر مع عرض نطاق ترددي قصير من واحد إلى ثلاثة نانومتر والانبعاثات إلى 530 نانومتر مع عرض نطاق ترددي كبير أكبر من 10 نانومتر.

تعيين وقت الاستحواذ إلى خمس وعشرين دقيقة مع دقة الوقت من ثانية واحدة على الأكثر. في كوفيت الكوارتز تمييع 30 ميكرولتر من تعليق الدهون لوس انجليس و NBD-C2 محلول الأسهم اللاكت وحاجز HKM قبل الحرب لإعداد عينة 570 ميكرولتر التي تحتوي على 200 الدهون الكلية ميكرومولار و 250 نانومولار أو NBD-C2 lact. إضافة شريط صغير اثارة المغناطيسي ووضع cuvette في حامل الفلوروميتر.

بمجرد أن يتم توازن العينة حراريا تشغيل القياس. بعد دقيقة واحدة، أضف 30 ميكرولتر من تعليق الليبوسوم LB إلى العينة. بعد ثلاث دقائق حقن LTP في العينة بحيث يكون التركيز النهائي للLTP 200 نانومولار، ثم الحصول على إشارة لمدة 21 دقيقة المتبقية.

إجراء تجربة موازية لتطبيع إشارة NBD. مزيج 30 ميكرولتر من لوس انجليس تعليق ليبوسوم التوازن مع 250 نانومولار NBD-C2 lact في المخزن المؤقت HKM في حجم نهائي من 570 ميكرولتر. بعد دقيقة واحدة، حقن 30 ميكرولتر من LB التوازن تعليق الدهون.

تحويل المنحنيات الحركية تقاس مع LTP من الفائدة لتحديد كمية PS نقلها من لوس انجليس لLB liposomes مع مرور الوقت. ثم تطبيع كل نقطة بيانات من المنحنى. قم بإجراء تجربة PI(4)P باستخدام نفس إعدادات وشروط باعث الكلمة كما هو الحال بالنسبة لمقاايسة نقل PS.

في cuvette، مزيج 30 ميكرولتر من تعليق ليبوسوم رطل والتحقيق NBD-PH FAPP مع العازلة HKM ساخنة مسبقا للحصول على حجم نهائي من 570 ميكرولتر. بمجرد الوصول إلى التوازن الحراري للعينة، ابدأ القياس. بعد دقيقة واحدة، حقن 30 ميكرولتر من تعليق الدهون لوس انجليس.

بعد ثلاث دقائق، حقن LTP من الفائدة وتسجيل الإشارة. إجراء تجربة ثانية لتطبيع إشارة NBD. مزيج 30 ميكرولتر من lb التوازن تعليق الدهون مع 250 نانومولار NBD-PH FAPP و 570 ميكرولتر من العازلة HKM.

بعد دقيقة واحدة، حقن 30 ميكرولتر من لوس انجليس تعليق الدهون التوازن. تحويل المنحنيات الحركية لتحديد كمية PI(4) P المنقولة من LB إلى LA liposomes مع مرور الوقت، ثم تطبيع كل نقطة بيانات. تحديد مدى كفاءة LTP.

إجراء انحدار خطي من نقاط البيانات الأولى من الحركية نقل للحصول على منحدر. تقسيم قيمة المنحدر من تركيز LTP في خليط التفاعل لتحديد عدد جزيئات الدهون المنقولة لكل بروتين في وحدة الوقت. تم التحقق من كفاءة استرداد C2 lact من الخرز مع تحليل صفحة SDS.

وأكد الطيف الماصة المرئي للأشعة فوق البنفسجية من اللاكت C2 المسمى مع NBD أن جميع جزيئات اللاكت C2 وصفت مع مجموعة NBD. تم تحديد نقاء اللاكت NBD-C2 وفلورة من قبل تحليل صفحة SDS. كان تفلور NBD-C2 lact أو NBD-PH FAPP أقصى حد عندما تم استخدام الليبوسومات التي تحتوي على PS أو PI (4) P للحضانة ، مما يشير إلى أن المستشعر كان مقيدا بالغشاء.

وشوهد تفلور منخفض عندما كان Osh6p حاضرا أيضا مما يشير إلى أن هذا البروتين استخرج بكفاءة PS أو PI (4) P من الليبوسومات. تظهر النتائج من فحص نقل PS باستخدام Osh6p ك LTP. تم حساب متوسط المنحنيات الحركية لنقل PS من الليبوسومات LA إلى ليبوسومات LB ، أو مخدرة ، أو غير مخدرة مع فوسفاتيدلينوزيتول -4-فوسفات.

تم تحديد متوسط معدل النقل الأولي PS من ثلاث تجارب متميزة. وبالمثل، تظهر هنا نتائج اختبار نقل PI(4)P باستخدام Osh6p ك LTP. جنبا إلى جنب مع متوسط المنحنيات الحركية التي تم الحصول عليها بعد تطبيع الإشارة.

تم قياس متوسط معدلات الانتقال مع الليبوسومات LA التي تم تعاطيها أو لم يتم تعاطيها مع PS. عند تنفيذ هذا البروتوكول استخدام المخزن المؤقت الطازجة وإعداد نفس الأيام. تقليل المعرض الخفيفة من الليبوسومات الفلورية والبروتينات، واستخدام البروتين NBD تنقية جيدا المسمى والاحتفاظ بها على الجليد. يمكن تأكيد ذلك عن طريق قياس PS و PI(4) P نقل بين العضية داخل الخلية prokaryotic باستخدام أجهزة استشعار الدهون الفلورية المشفرة وراثيا.

هذه التقنية تمهد الطريق لفهم أفضل للPS وPI (4) يتم توزيعها داخل الخلية، ونشاطهم يخضع لخصوصية عدة LTPS.