Name: الاحتواء المناعي لشبكية العين الكاملة مع طريقة إزالة الأنسجة الوضوح (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: تعلم طريقة CLARITY المُحسّنة لشبكية العين الكاملة لتحسين التصوير المناعي ثلاثي الأبعاد للخلايا العصبية الشبكية في الفئران. تُتيح هذه التقنية دراسة التغيرات الخلوية في حالات المرض بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ونود أن نشكر بينغ يي، وناثان سبيكس، وهاو ليو على الدعم التقني. وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للمنح الصحية EY022640 (D.-Q.Z.) وجائزة أبحاث الطلاب الجامعيين في جامعة أوكلاند (E.J.A.).

وقد أجريت رعاية الفئران وجميع الإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة للحيوانات المختبرية ووافقت عليها اللجان المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة أوكلاند (البروتوكول رقم 18071).
ملاحظة: يتم سرد أسماء الحلول والتركيبات الخاصة بهم في الجدول 1.
1. إعداد الأنسجة
<ol><li>قتل الفأر بجرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون،يليه خلع عنق الرحم.</li>
	<li>احث العينين بالملقط المنحني ونقلها إلى طبق بتري صغير مع 0.1 M PBS (الجدول 1). تحت مجهر تشريح، كزة حفرة صغيرة على طول تقاطع القرنية تصلب مع إبرة. نقل إلى 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) لمدة ساعة واحدة.</li>
	<li>نقل العين مرة أخرى إلى طبق مع برنامج تلفزيوني. تحت مجهر تشريح، استخدم مقص التشريح لقطع كل الطريق حول تقاطع القرنية والكليرا. إزالة القرنية والعدسة. قطع في قاعدة العصب البصري وتقشير بعناية تصلب قبالة مع ملقط لعزل شبكية العين.</li>
	<li>جعل أربعة تخفيضات صغيرة بالتساوي حول شبكية العين واستخدام فرشاة تلميح غرامة انخفض في برنامج تلفزيوني لوضعها مسطحة (GCL الجانب إلى أسفل) في شكل يشبه البرسيم على قطع مربع صغير من ورقة تصفية النيتروسليلوز لتحقيق الاستقرار في شبكية العين.</li>
	<li>نقل شبكية العين باستخدام ملقط لعقد زاوية ورقة النيتروسليلوز (دون لمس شبكية العين التي شنت) ووضعها في لوحة 48 جيدا مع 4٪ PFA لمدة 1 ساعة.</li>
	<li>نقل ورقة تصفية وشبكية العين إلى بئر مع برنامج تلفزيوني وغسل (3x لمدة 5 دقائق لكل منهما).</li>
	<li>نقل إلى A4P0 (الجدول 1) واحتضان بين عشية وضحاها في 4 °C مع التحريض لطيف.</li>
	<li>زيت نباتي ماصة في البئر لتغطية تماما حل A4P0. احتضان في حمام مائي في 40 درجة مئوية لمدة 3 ساعات مع عدم وجود اهتزاز.</li>
	<li>غسل (3x لمدة 5 دقائق لكل منهما) في برنامج تلفزيوني، والتأكد من أن جميع النفط قد تم شطف قبالة. إذا لزم الأمر، استخدم ماصة لإزالة الزيت المتبقي بعناية من أعلى البئر قبل الشطف الأخير.</li>
	<li>احتضان في 10٪ SDS في 40 درجة مئوية لمدة يومين مع اهتزاز لطيف. استبدال SDS مع حل جديد في اليوم الثاني.</li>
	<li>نقل ورقة تصفية وشبكية العين إلى برنامج تلفزيوني مع تريتون-X-100 (PBST، الجدول 1)وغسل (5x ل 1.5 ساعة لكل منهما).</li>
	<li>تخزين في 4 درجة مئوية في PBST مع 0.01٪ azide الصوديوم (NaN3)أو الانتقال مباشرة إلى نقص المناعة.</li>
</ol>2. مطابقة مؤشر التخزين الانكساري والمناعة
<ol><li>إزالة شبكية العين من ورقة التصفية عن طريق تقشير بلطف تشغيله مع فرشاة تلميح غرامة في PBST.</li>
	<li>احتضان شبكية العين في الأجسام المضادة الأولية (الجدول 2) المخفف في حل الحجب (الجدول 1) لمدة يومين عند 40 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف.</li>
	<li>غسل (5x، 1.5 ساعة لكل منهما) في PBST.</li>
	<li>احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة (الجدول 3) المخفف في حل حجب لمدة 2 أيام في 40 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف وحماية من الضوء من خلال ما تبقى من الإجراء.</li>
	<li>اغسل (5x، 1.5 ساعة لكل منهما) في 0.02 متر من الفوسفات (انظر الجدول 1).</li>
	<li>احتضان في معامل الانكسار القائم على سوربيتول مطابقة الحل (sRIMS، انظر الجدول 1)في 40 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع اهتزاز لطيف.</li>
</ol>3. تصاعد
<ol><li>قم بوضع مخطط تفصيلي لشريحة زجاجية مقاس 18 مم × 18 مم × 1.5 مم مع علامة دائمة ذات طرف رفيع لوضع علامة على حد مربع على الجزء الخلفي من شريحة المجهر الزجاجي.</li>
	<li>الوجه الشريحة أكثر واستخدام حقنة لتتبع الحدود مع خط رفيع من الشحوم السيليكون على الجزء الأمامي من الشريحة، وترك فجوة صغيرة في زاوية واحدة لحل تصاعد الزائدة للهروب.</li>
	<li>نقل شبكية العين إلى وسط المنطقة المحيطة وترتيب مع فرشاة غرامة تلميح بحيث تقع مسطحة مع الجانب مستقبلات ضوئية ضد الشريحة الزجاجية.</li>
	<li>ماصة ما يقرب من 60 ميكرولتر من sRIMS بحيث يغطي شبكية العين بالارض ويمتد إلى زاوية واحدة من الضميمة، مع الحرص على أن شبكية العين يبقى شقة وفي مكانها.</li>
	<li>تطبيق coverslip بدءا من الزاوية مع SRIMS وخفض ببطء حتى يمس الشحوم على جميع الجوانب، وتجنب تشكيل فقاعات الهواء.</li>
	<li>ضع كومة من 3 قطع تغطي على كل جانب من شبكية العين المركبة كمسافة. استخدام حافة طويلة من شريحة أخرى للضغط على أسفل coverslip بحيث جبل مسطحة وحتى.</li>
	<li>تخزين الشرائح مسطحة عند 4 درجة مئوية حتى التصوير.</li>
</ol>4. التصوير
<ol><li>عينات الصورة على المجهر الفلوري التقليدي أو المجهر الكونفوكوكال(جدول المواد). ابدأ بوضع الشريحة على مرحلة المجهر وتحديد موقع العينة. ملاحظة: إذا تم استخدام مجهر موضوعي مقلوب، ضع الشريحة رأسا على عقب على المسرح، أولا ضمان أن المناطق المكشوفة من الشريحة واضحة من جميع الشحوم السيليكون والحل المتصاعد.</li>
	<li>للحصول على صور مكدسة z لعينات تحمل علامة مشتركة، ركز أولا على الإشارة في كل قناة على حدة وحدد وقت التعرض أو سرعة المسح الضوئي، للمجاهر الفلورية أو البؤرية، على التوالي.</li>
	<li>تعيين النطاق للكدسة z إما عن طريق تعيين المستوى البؤري يدويا في أعلى وأسفل النطاق المطلوب، أو عن طريق تعيين نقطة الوسط ثم تحديد نطاق حول نقطة الوسط.</li>
	<li>ضبط حجم الخطوة أو عدد الشرائح حسب الرغبة.</li>
	<li>التقاط الصورة وحفظ الملف الأصلي وكذلك تصديره كملف TIFF أو تنسيق آخر المطلوب.</li>
</ol>5. تحليل الصور
<ol><li>استخدام برنامج تحليل الصور من اختيار(جدول المواد)لضبط السطوع والتباين في كل قناة حتى يتحقق الوضوح الأمثل في كل من الصور المفردة وتقديم 3 الأبعاد من z-كومة. ملاحظة: إذا كان حجم الخطوة المحددة صغيرة بما فيه الكفاية، يمكن أيضا إجراء deconvolution 3D لتحسين الإشارة.</li>
</ol>

<ol><li>Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+and+retinal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Documenta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Dopamine and retinal function.</a> Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).</li>
<li>McMahon, D. G., Iuvone, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+organization+of+the+mammalian+retina%3A+from+gene+regulation+to+physiology+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).</li>
<li>Prigge, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M1+ipRGCs+Influence+Visual+Function+through+Retrograde+Signaling+in+the+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina.</a> Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).</li>
<li>Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin+mediates+retrograde+visual+signaling+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina.</a> PLoS One. 7 (8), 42647(2012).</li>
<li>Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GluA2-containing+calcium-impermeable+AMPA+receptors+on+dopaminergic+amacrine+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina.</a> Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).</li>
<li>Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+Receptors+Contribute+to+Retrograde+Synaptic+Transmission+from+Ganglion+Cell+Photoreceptors+to+Dopaminergic+Amacrine+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279(2017).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332(2013).</li>
<li>Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+method+to+perform+CLARITY+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Simplified method to perform CLARITY imaging.</a> Molecular Neurodegeneration. 9, 19(2014).</li>
<li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li>
<li>Magliaro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+CLARITY%3A+Quantitative+Optimization+of+the+Diffusion+Based+Delipidation+Protocol+for+Genetically+Labeled+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue.</a> Frontiers in Neuroscience. 10, 179(2016).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Zheng, H., Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+CLARITY+for+visualizing+immunofluorescence+labeling+in+the+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain.</a> Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).</li>
<li>Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+retinal+dopaminergic+neurons%3A+differential+maturation+of+somatodendritic+and+axonal+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments.</a> Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).</li>
</ol>

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح مالية متنافسة.

تعديل بروتوكول CLARITY لشبكية العين كاملة التركيب. لقد قمنا بتبسيط بروتوكول CLARITY لتحقيق البلمرة الكافية دون الحاجة إلى إخلاء فراغ أو غرفة الجفاف ، كما هو مستخدم في معظم الدراسات السابقة7و9و11. يتم تثبيط عملية البلمرة عن طريق الأكسجين ، مما يتطلب عزل العينة عن الهواء أثناء خطوة البلمرة في البروتوكول. ومع ذلك ، بدلا من إزالة الغاز مع النيتروجين ، وجدنا أن تغطية العينة بالزيت عزلت العينة بما يكفي للسماح بالبو...

قد تكون الشبكية الفقارية هي الجزء الأكثر سهولة في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، وهي بمثابة نموذج ممتاز لدراسة تطور الدماغ وبنيته ووظيفته. يتم توزيع خمس فئات من الخلايا العصبية في شبكية العين في ثلاث طبقات نووية مفصولة طبقتين شكلية. تتكون الطبقة النووية الخارجية (ONL) من مستقبلات ضوئية كلاسيكية (قضبان ومخاريط) تحول الضوء إلى إشارات كهربائية. تتم معالجة الإشارات الكهربائية بواسطة الخلايا العصبية في الطبقة النووية الداخلية (INL)، بما في ذلك الخلايا ثنائية القطب والأفقية والأماكرين، ثم تنتقل إلى خلايا العقدة الشبكية (RGCs) في طبقة خلايا العقدة (GCL). RGCs هي الخلايا العصبية الناتجة من شبكية العين، مع محاور عصبية إسقاط إلى الدماغ للمساهمة في تشكيل الصورة وغير تشكيل الصورة وظيفة بصرية. بالإضافة إلى ذلك، توفر ثلاثة أنواع من الخلايا الدبقية (خلايا مولر، والأستروغليا، والميكروجليا) العناصر الغذائية للخلايا العصبية وتحمي الخلايا العصبية من التغيرات الضارة في بيئتها خارج الخلية.
واحد السكان الفرعية المتخصصة من خلايا الاماكرين تنتج وتطلق الدوبامين, neuromodulator هامة في الجهاز العصبي المركزي, إعادة تكوين الدوائر العصبية الشبكية خلال التكيف مع الضوء1,2. خلايا الدوبامين amacrine (DACs) لديها ميزة فريدة من ملامح مورفولوجية. وتقع سوماتا بهم في INL القريبة مع dendrites ramifying في الجزء الأكثر قاصرة من طبقة plexiform الداخلية (IPL). عمليات تشبه أكسون من DACs هي unmyelinated، رقيقة وطويلة، متفرعة بشكل متفرق، وتحمل الدوالي (مواقع إطلاق الدوبامين). أنها تشكل الضفيرة الكثيفة مع dendrites في IPL، بما في ذلك هياكل تشبه حلقة حول سوماتا من خلايا AII amacrine. المحاور أيضا تشغيل من خلال INL نحو OPL, تشكيل مسار الطرد المركزي عبر شبكية العين3. لقد أثبتنا أن عمليات DAC تعبر عن المستقبلات استجابة لإطلاق الغلوتامات من الخلايا العصبية presynaptic، بما في ذلك الخلايا ثنائية القطب وخلايا العقدة الشبكية الحساسة للضوء في جوهرها (ipRGCs)4،5،6. ومع ذلك، فمن غير الواضح ما إذا كانت مستقبلات الغلوتامات تعبر عن محاور الفأس، التشعبات، أو كليهما لأنها مقطوعة في أقسام الشبكية الرأسية ولا يمكن تمييزها عن بعضها البعض5،6. يجب إجراء التلطخ المناعي في شبكية العين الكاملة للكشف عن تفريع ثلاثي الأبعاد ل DACs ووجود مستقبلات الغلوتامات على المقصورات دون الخلوية. على الرغم من أن شبكية العين شفافة نسبيا، إلا أن سمك شبكية العين ذات التركيب الكامل للفأر يبلغ حوالي 200 ميكرومتر، مما يحد من اختراق الأجسام المضادة للأنسجة العميقة، فضلا عن تقليل اختراق الضوء للتصوير عالي الدقة بسبب تشتت الأنسجة الخفيفة. للتغلب على هذه القيود، قمنا بتكييف طريقة التهذييل الهيدروجيل الأنسجة المتوافقة (CLARITY) التي تم تطويرها مؤخرا لأقسام الدماغ السميكة إلى شبكية العين الماوس جبل كامل7.
تم تطوير طريقة CLARITY في الأصل من قبل مختبر Deisseroth لاحتواء المناعة وتصوير عينات الدماغ السميكة7. ويستخدم المنظفات القوية، كبريتات دودسيل الصوديوم (SDS) والكهربائية لإزالة مكونات الدهون (التي تسبب تشتت الضوء الأنسجة)، وترك البروتينات والأحماض النووية في مكانها. يتم استبدال الدهون إزالتها مع سقالة شفافة تتكون من مونومرات هيدروجيل مثل الأكريلاميد لدعم بنية البروتين المتبقية. يمكن تسمية الأنسجة المطهية عن طريق الكيمياء المناعية وصورت مع زيادة كبيرة في عمق اختراق الضوء من خلال الأنسجة (تصل إلى عدة ملليمترات تحت سطح الأنسجة). ومنذ ذلك الحين، تم تحسين طريقة CLARITY وتبسيطها من قبل العديد من مجموعات البحث8و9و10. يستخدم بروتوكول CLARITY المعدل تقنية إزالة سلبية لتجنب تلف الأنسجة المحتمل الناتج عن الكهتروفورسيس لتطهير الدماغ كله والأعضاء الأخرى السليمة11. ومع ذلك، لم يتم تطبيق هذه الطريقة بعد على شبكية العين كاملة التركيب. هنا، قمنا بتكييف تقنية CLARITY السلبية لشبكية العين الكاملة لجعلها أكثر شفافية للكيمياء المناعية والتصوير. وجدنا أن غالبية بروتينات الشبكية التي تم اختبارها تم الحفاظ عليها خلال هذه العملية للكيمياء المناعية. باستخدام معامل الانكسار مطابقة الحل، كنا قادرين على صورة الخلايا العصبية الشبكية عبر سمك ما يقرب من 200 ميكرومتر من ONL إلى GCL في شبكية العين جبل كامل.

<table><tbody><tr><td>16٪ بارافورمالديهايد</td><td>علوم المجهر الإلكتروني</td><td>15710</td><td>مثبت</td></tr><tr><td>أكريلاميد</td><td>فيشر التكنولوجيا الحيوية</td><td>BP170</td><td>مونومر هيدروجيل</td></tr><tr><td>Axio Imager.Z2</td><td>مجهر الفلور</td><td>زايس</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>فيشر العلمي</td><td>BP1600</td><td>عامل حجب</td></tr><tr><td>الكسوف Ti</td><td>نيكون أدوات</td><td></td><td>المسح متحد البؤر المجهر</td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>BDH0258</td><td>مكون العازلة</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>مكون العازلة</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>S9763</td><td>مكون العازلة</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td> مكون <td>العازلة</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>S0751</td><td>مكون العازلة</td></tr><tr><td>NaN3</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td>مادة حافظة للجراثيم</td></tr><tr><td>NDS</td><td>Aurion</td><td>900.122</td><td>عامل حجب</td></tr><tr><td>NIS عناصر AR</td><td>نيكون</td><td></td><td>برنامج تحليل الصور</td></tr><tr><td>SDS</td><td>BioRad</td><td>1610301</td><td>عامل إزالة الدهون</td></tr><tr><td>سوربيتول</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>51876</td><td>مكون عازلة</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>الفاعل بالسطح</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337</td><td>الخافض للتوتر السطحي</td></tr><tr><td>VA-044</td><td>Wako Chemicals</td><td>011-19365</td><td>بادئ حراري</td></tr></tbody></table>

الاحتواء المناعي لشبكية العين الكاملة مع طريقة إزالة الأنسجة الوضوح

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

تم تعديل طريقة التهذير الهيدروجيل الأنسجة (CLARITY)، التي وضعت أصلا من قبل مختبر Deisseroth، وتستخدم على نطاق واسع لاحتواء المناعة والتصوير لعينات الدماغ سميكة. ومع ذلك، لم يتم استخدام هذه التكنولوجيا المتقدمة بعد لشبكية العين كاملة التركيب. على الرغم من أن شبكية العين شفافة جزئيا، إلا أن سمكها البالغ حوالي 200 ميكرومتر (في الفئران) لا يزال يحد من اختراق الأجسام المضادة للأنسجة العميقة وكذلك الحد من اختراق الضوء للتصوير عالي الدقة. هنا، قمنا بتكييف طريقة CLARITY لشبكية العين الماوس جبل كامل عن طريق البلمرة لهم مع مونومر الأكريلاميد لتشكيل هيدروجيل نانوبري ومن ثم تطهيرها في كبريتات دودسيل الصوديوم للحد من فقدان البروتين وتجنب تلف الأنسجة. كانت شبكية العين المجهزة بالوضوح ملطخة بالمناعة بأجسام مضادة للخلايا العصبية الشبكية والخلايا الدبقية والبروتينات المتشابكة ، مثبتة في محلول مطابق لمؤشر الانكسار ، وصورت. تظهر بياناتنا أن CLARITY يمكن أن يحسن جودة تلطيخ المناعة الكيميائية القياسية والتصوير للخلايا العصبية الشبكية والخلايا الدبقية في إعداد التركيب الكامل. على سبيل المثال ، تم تحسين الدقة ثلاثية الأبعاد للهياكل الدقيقة الشبيهة بالفأس والتشجرات لخلايا amacrine الدوبامين بشكل كبير من خلال CLARITY. بالمقارنة مع شبكية العين غير المصنعة كاملة التركيب ، يمكن أن يكشف CLARITY عن وجود مناعة للبروتينات المتشابكة مثل بروتين الكثافة بعد المتشابك 95. تظهر نتائجنا أن CLARITY يجعل شبكية العين أكثر شفافية بصريا بعد إزالة الدهون ويحافظ على الهياكل الدقيقة للخلايا العصبية الشبكية وبروتيناتها ، والتي يمكن استخدامها بشكل روتيني للحصول على تصوير عالي الدقة للخلايا العصبية الشبكية وهياكلها دون الخلوية في إعداد التركيب الكامل.

شبكية العين المعدلة المعالجة CLARITY هي أنسجة شفافة بصريا. لصياغة طريقة تطهير الأنسجة التي تتوافق مع التطبيقات المناعية الكيميائية في شبكية العين مع توفير الهذيان الكافي والاحتفاظ السلامة الهيكلية للبروتينات الخلوية، قمنا بتكييف طريقة إزالة الأنسجة وضوح لشبكية العين الماوس جبل كامل. تمكنا من تبسيط البروتوكول وتعديله لشبكية العين كاملة التركيب (انظر البروتوكول). بعد الانتهاء من التهجين الأنسجة, تطهير, ومطابقة مؤشر الانكسار, شبكية العين معالجتها مع هذا البروتوكول وضوح تعديل أظهرت الشفافية البصرية كاملة ...

هنا نقدم بروتوكولا لتكييف طريقة وضوح أنسجة الدماغ لشبكية العين كاملة جبل لتحسين نوعية تلطيخ المناعية القياسية والتصوير عالي الدقة من الخلايا العصبية الشبكية وهياكلها دون الخلوية.

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

يسمح هذا البروتوكول بالتحقيق في مورفولوجيا الدقيقة للخلايا العصبية الشبكية ويمكن أن يعطي فكرة عن التغيرات المورفولوجية الخلوية ودون الخلوية التي تحدث في حالات المرض. هذه الطريقة تحسن بشكل كبير الشفافية البصرية للشبكية ويسمح عالية الدقة, التصوير ثلاثي الأبعاد, الأسلاك الدائرة, وهياكل الخلوية الفرعية غرامة من الخلايا العصبية الشبكية في إعداد هرمون شبكية العين. احث عيون الماوس مع ملقط منحني ونقلها إلى طبق بيتري صغير مع برنامج تلفزيوني 0.1 M.كزة حفرة صغيرة على طول تقاطع القرنية تصلب مع الإبرة تحت المجهر تشريح، ثم نقل العين إلى 4٪ فورمالديهايد السلطة لمدة ساعة واحدة. نقل العين مرة أخرى إلى طبق مع برنامج تلفزيوني. تحت مجهر تشريح، استخدم مقص التشريح لقطع كل الطريق حول تقاطع كورنيوسكليال.إزالة القرنية والعدسة. ثم قطع عليه في قاعدة العصب البصري وتقشير بعناية تصلب قبالة مع ملقط لعزل شبكية العين. جعل أربعة تخفيضات صغيرة بالتساوي حول شبكية العين واستخدام فرشاة تلميح غرامة انخفض في برنامج تلفزيوني لوضعها الجانب GCL شقة أسفل في شكل يشبه البرسيم على قطع مربع صغير من ورقة تصفية النيتروسليلوز.التقط زاوية ورق النيتروسليلوز مع ملقط وضعه في لوحة بئر 48 مع 4٪ فورمالديهايد الطاقة لمدة ساعة واحدة، ثم نقل ورقة التصفية والشبكية إلى بئر مع برنامج تلفزيوني وغسل ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منهما. ذوبان A4P0 الحل على الجليد. ثم نقل شبكية العين إلى محلول A4P0 واحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية مع التحريض لطيف.أضف الزيت النباتي إلى البئر لتغطية محلول A4P0 بالكامل. احتضان في حمام مائي في 40 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات مع عدم اهتزاز. ثم يغسل ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق لكل غسل.احتضان شبكية العين في كبريتات دودسيل الصوديوم 10٪ في 40 درجة مئوية لمدة يومين مع اهتزاز لطيف ثم نقل ورقة التصفية والشبكية إلى PBS مع تريتون X-100 وغسل خمس مرات لمدة 90 دقيقة لكل غسل. بعد الغسل النهائي، قم بتخزين الشبكية عند أربع درجات مئوية في PBS-T مع 0.01٪ من أزيد الصوديوم أو انتقل مباشرة إلى تلطيخ المناعة. إزالة شبكية العين من ورقة التصفية عن طريق تقشير بلطف تشغيله مع فرشاة تلميح غرامة في PBS-T.المحتضنة في الأجسام المضادة الأولية المخفف في حل حجب لمدة يومين في 40 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف. بعد الحضانة، اغسل خمس مرات لمدة 90 دقيقة في PBS-T. احتضان شبكية العين مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة المخففة في حل حجب لمدة يومين في 40 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف.حماية العينات من الضوء طوال الفترة المتبقية من الإجراء. غسل شبكية العين خمس مرات لمدة 90 دقيقة في 0.02 متر الفوسفات العازلة. أخيرا احتضان شبكية العين في معامل الانكسار القائم على سوربيتول مطابقة الحل في 40 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع اهتزاز لطيف.مخطط زلة غطاء زجاجي مع علامة دائمة تلميح غرامة لوضع علامة على حدود مربعة على الجزء الخلفي من شريحة المجهر الزجاجي. الوجه الشريحة واستخدام حقنة لتتبع الحدود مع خط رفيع من الشحوم السيليكون على الجزء الأمامي من الشريحة. ترك فجوة صغيرة في زاوية واحدة للحل تصاعد الزائدة للهروب.نقل شبكية العين إلى وسط المنطقة المحيطة ووضعها مع فرشاة طرف غرامة بحيث تقع شقة مع الجانب مستقبلات ضوئية ضد الشريحة الزجاجية. ماصة ما يقرب من 60 ميكرولتر من sRIMS بحيث يغطي شبكية العين بالارض ويمتد إلى زاوية واحدة من الضميمة. تأكد من أن الشبكية تبقى مسطحة وفي مكانها.تطبيق زلة الغطاء، بدءا من الزاوية مع SRIMS وخفض ببطء حتى يمس الشحوم على جميع الجوانب. ضع كومة من ثلاث زلات غطاء على كل جانب من شبكية العين المركبة كمسافة. استخدام حافة طويلة من شريحة أخرى للضغط على أسفل زلة الغطاء بحيث جبل مسطحة وحتى.تخزين الشرائح في أربع درجات مئوية حتى التصوير. ابدأ بوضع الشريحة على مرحلة المجهر وتحديد موقع العينة. للحصول على صور Z مكدسة من العينات، والتركيز أولا على إشارة في كل قناة على حدة وتعيين وقت التعرض أو سرعة المسح الضوئي للمجاهر الفلورية أو confocal على التوالي.تعيين النطاق للكدسة Z إما عن طريق تعيين المستوى البؤري يدويا في أعلى وأسفل النطاق المطلوب أو عن طريق تعيين نقطة الوسط ثم تحديد نطاق حول نقطة الوسط. ضبط حجم الخطوة أو عدد الشرائح حسب الرغبة. التقاط الصورة وحفظ الملف الأصلي.ثم تصديرها كملف TIF أو تنسيق آخر المطلوب. استخدام تحليل الصور، والبرمجيات المفضلة لضبط السطوع والتباين في كل قناة حتى يتم تحقيق الوضوح الأمثل في كل من الصور المفردة وتقديم ثلاثي الأبعاد من المكدس Z. عند معالجتها مع بروتوكول CLARITY المعدلة الشفافية البصرية الكاملة في جميع أنحاء سمك شبكية العين لوحظ بالمقارنة مع شبكية العين التحكم غير المجهزة.Z مكدسة الصور لScinin المخاريط المسمى في ONL، TH المسمى DAC في INL، وRBPMS RGCs ملحوظ في GCL تظهر هنا. لوحظ الموقع النسبي للخلايا العصبية في جميع أنحاء سمك شبكية العين بأكمله في صورة التراكب. تمت مقارنة تلطيخ TH و CLARITY بشبكية العين الكاملة في جبل مع الصور التي تم الحصول عليها من التحضير القياسي.تم الكشف عن Dendrites والعمليات الشبيهة بالمكون المحوري ل DACs بوضوح أكبر في شبكية العين المجهزة الوضوح مما كانت عليه في شبكية العين القياسية. أظهرت العمليات الشبيهة بالفأس من DACs هياكل كاملة تشبه الحلقة في شبكية العين الوضوح مقارنة بشبكية العين القياسية. كانت الهياكل الشبيهة بالحلقة لشبكية العين CLARITY التي تم التقاطها باستخدام المجهر الفلوري متطابقة تقريبا مع تلك التي لوحظت باستخدام المجهر الكونف البؤري.كما ركضت العمليات الشبيهة بالمقرن نحو شبكية العين الخارجية. وأظهرت تلطيخ المناعة ضد GluA2 و PSD-95 puncta متميزة، والكشف عن GluA2 الفردية التي تحتوي على مستقبلات AMPA ومواقع ما بعد متشابك المفترضة، على التوالي. وأظهرت صورة تراكب بعض puncta على عمليات لجنة المساعدة الإنمائية.وعرضت نقاط التوطين المشترك المفترض في طائرات XZ وYZ وXY وTH المترجمة بشكل مشترك مع كل من GluA2 و PSD-95. من المهم أن تبقى شبكية العين مسطحة أثناء عملية بلمرة الهيدروجيل بحيث يمكن للشبكية التي تم تطهيرها وضع مسطحة لعملية التركيب والتصوير.

immunostaining-whole-mount-retinas-with-clarity-tissue-clearing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

يوفر شبكية العين الفئران حديثي الولادة نموذجا الفسيولوجية تتميز كذلك من الأوعية الدموية، والذي يسمح التحقيقات عن دور الجينات المختلفة أو الأدوية التي تعدل الأوعية الدموية...

كله جبل تلوين مناعي للشبكية الفأر حديثي الولادة المعنية بالتحقيق في الأوعية الدموية<em&gt; في الجسم الحي</em

البروتوكول الموصوف هنا مخصص للتقييم الهيكلي لإعداد الشبكية الكاملة. يتضمن ذلك أوصافا لتشريح الأنسجة ، والتركيب على غشاء متعدد تترافلورو إيثيلين مجفف بالماء (PTFE) ، وتحميل البلعة بعلامات الفلورسنت ، ومقارنة التثبيت مع الكربوديميد وبارافورمالديهايد للتحليل الكيميائي المناعي للمكونات الخلوية والمشبكية.

بروتوكول الأمثل لإعداد Wholemount الشبكية للتصوير والمناعية

ACT-المعزوفة (نشط الوضوح تقنية ضغط المتعلقة نقل فعال ومستقر من الجزيئات في الأجهزة) يمكن إزالة الأنسجة سريعة وفعالة وغير مكلفة ولكن واختراق الأجسام المضادة السريع إلى أنسجة مسح عن طريق الانتشار السلبي أو تسليم بمساعدة الضغط. باستخدام هذه الطريقة، مجموعة واسعة من الأنسجة يمكن إزالتها، immunolabeled بواسطة الأجسام المضادة متعددة، والحجم تصوير.

ACT-المعزوفة: المقاصة الأنسجة البيولوجية وطرق Immunolabeling للتصوير حجم

علينا أن نظهر ثلاث تقنيات إعداد الأنسجة المختلفة للتصور المناعي للفئران بيريسيتيس microvascular الشبكية و أي البرد-أقسام والجامع--يتصاعد والعزلة ناقص التوتر لشبكة الأوعية الدموية.

البرد الشبكية-الفروع، الجامع--يتصاعد، والتحضيرات ناقص التوتر المفرج معزولة للتصور المناعي من بيريسيتيس ميكروفاسكولار

يسمح الجمع بين وضع العلامات على الأجسام المضادة، والمقاصة البصرية، والفحص المجهري الضوئي المتقدم، بإجراء تحليل ثلاثي الأبعاد للهياكل أو الأجهزة الكاملة. يوصف هنا هو طريقة بسيطة للجمع بين وضع العلامات المناعية من شرائح الكلى سميكة، والمقاصة البصرية مع cinnamate إيثيل، والتصوير البؤري التي تمكن التصور والقياس الكمي للهياكل الكلوية ثلاثية الأبعاد.

التطهير البصري والتصوير من أنسجة الكلى المسماة بالمناعة

يصف هذا البروتوكول إجراء عزل شبكية العين الفأرية بالكامل وإجراء التلوين المناعي لتسمية جميع خلايا العقدة الشبكية (RGCs). يتبع العملية التصوير والعد التلقائي ل RGCs باستخدام البرامج القائمة على الذكاء الاصطناعي ، مما يوفر طريقة بسيطة وسريعة ودقيقة لقياس RGCs في شبكية الفأر بأكملها.

تلطيخ مناعي كامل التثبيت والعد التلقائي لخلايا العقدة الشبكية للفأر

تم فحص الخلايا المحيطة في الأوعية الدموية الشبكية عن طريق تلطيخ الفلورسنت المناعي باستخدام مستقبلات عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية β بعد الحقن المداري الرجعي ليكتين الطماطم الفلوري. تمت معالجة شبكية العين المسماة بطريقة تطهير الأنسجة وتم تركيبها بالكامل لتصور المناظر ثلاثية الأبعاد للخلايا المحيطة بالأوعية الدموية الشبكية تحت مجهر متحد البؤر.

تصور ثلاثي الأبعاد للخلايا الوعائية الشبكية في الفئران عن طريق التلوين المناعي 

يجمع هذا البروتوكول بين المقاصة البصرية ووضع العلامات المناعية للتصوير متحد البؤر بالحجم الكامل لحضيات الشبكية المثبتة بالكامل. إنه يحافظ على الهيكل ثلاثي الأبعاد ، مما يتيح التصور التفصيلي للمسارات العصبية الرئيسية ، ويحسن دراسة نضوج الشبكية ، والتنظيم المكاني ، وتطبيقاته المحتملة في نمذجة الأمراض والطب الشخصي.

تصور عضوي الشبكية بالكامل مع الدقة الخلوية

نحن تصف الإجراء الذي قام...

التصور الجهاز العصبي الجنينية في جبل لالجامع ذبابة الفاكهة الأجنة

تحديد Immunocytochemical الطرفية من الألياف العصبية الحسية فرعية (والكشف عن بروتين تعبير فيها) هي المفتاح لفهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء الإحساس الطرفية. نحن هنا تصف طرق تحضير عينات الأنسجة المحيطية / الحشوية ، مثل العظام والجلد أطرافهم ، لimmunostaining محددة من الألياف العصبية الطرفية الحسية.

تحضير الأنسجة وImmunostaining من الألياف العصبية الحسية ماوس التعصيب الجلد والعظام الاطراف

تعلم طريقة CLARITY المُحسّنة لشبكية العين الكاملة لتحسين التصوير المناعي ثلاثي الأبعاد للخلايا العصبية الشبكية في الفئران. تُتيح هذه التقنية دراسة التغيرات الخلوية في حالات المرض بدقة عالية.

الاحتواء المناعي لشبكية العين الكاملة مع طريقة إزالة الأنسجة الوضوح

استكشف المزيد من الفيديوهات