اختبار فعالية المضادات الحيوية في نموذج الجسم الحي السابق من Pseudomonas aeruginosa والمكورات العنقودية أوريوس بيو فيلمز في الرئة التليف الكيسي
يناير 22, 2021
يمكن استخدام سير العمل هذا لإجراء اختبار قابلية المضادات الحيوية باستخدام نموذج الجسم الحي السابق الراسخ للبيو فيلم البكتيري في رئتي الأفراد المصابين بالتليف الكيسي. استخدام هذا النموذج يمكن أن تعزز الصحة السريرية لل MBEC (الحد الأدنى من تركيز الاستئصال بيو فيلم) المقايسات.
هذه الطريقة تسمح لك لزراعة البكتيريا في بيئة تؤدي إلى فسيولوجيا الخلايا مماثلة ومورفولوجيا بيو فيلم لتلك التي تراها في التهابات الرئة التليف الكيسي. الرئتين هي منتجات النفايات في صناعة اللحوم، لذلك لا توجد مخاوف أخلاقية. يوفر النموذج منصة لمحاكاة العدوى البشرية دون الحاجة إلى نموذج حيواني حي.
هذه التقنية يعطي الباحثين طريقة جديدة لفحص الأدوية المرشحة لاحتمال دخول وتدمير الأغشية الحيوية التي تتشكل في الرئتين التليف الكيسي. مع مزيد من التطوير والتحقق من الصحة، ونحن نعتقد أن نموذج EVPR يمكن أن يكون الاستخدام المحتمل لاختبار قابلية المضادات الحيوية المتخصصة والفردية. الحصول على الرئتين مباشرة بعد ذبح ونقلها إلى المختبر في صندوق بارد المحلية.
العمل على سطح معقم وتحت لهب. ضع الرئتين على لوحة تقطيع بلاستيكية نظيفة مغطاة بورق الألومنيوم المعبي تلقائيا ، وتحقق من أن القصيبات لا تزال سليمة. الرئتين ليست مناسبة للاستخدام إذا كان هناك أي ضرر في المسلخ أو أثناء النقل.
سخني سكين منصة نقالة تحت اللهب والمس السكين لفترة وجيزة إلى منطقة الرئة المحيطة بالبرونيكول لتعقيم سطح الأنسجة. قطع الأنسجة السطحية المحيطة برونشيول باستخدام شفرة حلاقة محمولة على العقيمة، مما يجعل شقوق موازية لبرونيكول لمنع أي ضرر. بمجرد أن يتعرض القصيبات الهوائية، قم بإجراء شق مقطعي عرضي عبر القصيبات الهوائية عند أعلى نقطة مرئية.
باستخدام ملقط معقم، عقد طفيفة نهاية حرة من القصيبات وقطع أي الأنسجة غير المرغوب فيها المتبقية باستخدام شفرة حلاقة محمولة على العقيمة. إجراء شق المقطع العرضي النهائي عبر الشعب الهوائية قبل أي تفريع مرئية لإزالة القصيبات من الرئتين. وضع القصيبات في أول غسل DMEM RPMI 1640.
اتركه في الغسيل وحصاد أجزاء إضافية من القصبات الهوائية من نفس الرئة لتسفر عن أقسام أنسجة كافية للتجربة المخطط لها. ضع أي أقسام إضافية من القصبات الهوائية من نفس الرئة في الغسيل واتركها في الغسيل لمدة دقيقتين على الأقل. إزالة القصيبات من الغسيل الأول، ووضع العينات في طبق بيتري معقمة.
عقد طفيفة كل القصيبات مع ملقط معقمة، مع الحرص على عدم تلف الأنسجة. إزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة الرخوة المتبقية، وقطع الأنسجة إلى شرائح خمسة ملليمترات واسعة باستخدام مقص تشريح معقمة. ضع جميع شرائط الأنسجة القصبية في غسل DMEM RPMI 1640 الثاني.
اتركها في الغسيل لمدة دقيقتين على الأقل، ثم أزيلي شرائح الأنسجة من الغسيل الثاني باستخدام ملقط معقم ووضعها في طبق بيتري نظيف ومعقم. إزالة أي الأنسجة الرخوة المتبقية تعلق على القصيبات، وقطع الشرائط إلى مربعات باستخدام مقص تشريح معقمة. إضافة الثالث DMEM RPMI 1640 يغسل في طبق بيتري ومزيج طفيفة قطع الأنسجة في غسل عن طريق تدوير الطبق.
صب غسل الثالث من طبق بيتري دون إزالة قطع الأنسجة. ثم أضف غسل SCFM النهائي، وضمان تغطية جميع قطع الأنسجة. تعقيم الأنسجة في SCFM تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة خمس دقائق.
استخدام ملقط معقم لنقل كل قطعة أنسجة الشعب الهوائية المعقمة في آبار فردية من لوحة 24 جيدا تحتوي على منصات Agarose SCFM. لإصابة كل قطعة نسيج بالسلالة البكتيرية المطلوبة ، المس مستعمرة تزرع على طبق أجار مع طرف إبرة عيار 29 متصلة بحقنة الأنسولين المعقمة 0.5 ملليلتر ، ثم المس المستعمرة على قطعة الأنسجة ، وخز السطح بلطف. بالنسبة للضوابط غير المصابة ، وخز بلطف سطح قطعة الأنسجة مع غيض من الإبرة ، ثم استخدم ماصة لإضافة 500 ميكرولتر من SCFM إلى كل بئر.
تعقيم غشاء الختم تنفس لكل لوحة 24 جيدا تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق. إزالة الغطاء من لوحة 24 جيدا واستبداله مع غشاء تنفس، ثم احتضان لوحات في 37 درجة مئوية دون اهتزاز. إعداد مجموعات تكرار قطع الرئة من اثنين على الأقل من الرئتين مستقلة، وذلك باستخدام مجموعة واحدة للسيطرة السلبية، ومجموعة واحدة لكل تركيز من المضادات الحيوية ليتم اختبارها.
بعد 48 ساعة من الحضانة ، فحص بصريا قطع الأنسجة غير المصابة لنمو البكتيريا الذاتية ، مما يؤدي إلى أن تكون الوسائط المحيطة بهذه الأقسام عكرة. إذا لوحظ نمو نموذجي لأنواع الدراسة المختارة، فأعد تشغيل التجربة بالرئتين الطازجتين. إذا لم تظهر أقسام الأنسجة غير المصابة أي نمو بكتيري أو الحد الأدنى، فاستعد صفيحة غسيل واحدة من 24 بئرا ولوحة علاج واحدة من 24 بئرا.
يجب أن يحتوي كل بئر من لوحة العلاج على 500 ميكرولتر من SCFM الطازجة دون مضادات حيوية ، أو مع المضادات الحيوية ذات الاهتمام. إزالة كل قطعة الأنسجة المصابة من لوحة الحضانة مع ملقط اللهب المعقمة. دوامة لفترة وجيزة في بئر جديدة من لوحة الغسيل لإزالة أي خلايا بكتيرية غير بيو فيلم المرتبطة ونقله إلى البئر المناسب من لوحة العلاج.
ختم لوحة العلاج مع غشاء تنفس جديدة، ثم احتضانه في 37 درجة مئوية دون اهتزاز لمدة 18 إلى 24 ساعة. استخدم ملقط معقم باللهب لإزالة كل قطعة رئة من لوحة 24 بئرا ، ووضعها في أنبوب تجانس معقم من ملليلترين يحتوي على ملليلتر واحد من PBS وغرام واحد من الخرز المعدني. فاز حبة لمدة 40 ثانية في أربعة أمتار في الثانية الواحدة.
تخفيف تسلسلي تجانس الرئة باستخدام برنامج تلفزيوني، ولوحة على أجار LB لتحديد وحدات تشكيل مستعمرة في الفردية، غير المعالجة، وقطع الأنسجة المعالجة بالمضادات الحيوية. عندما تزرع في الرئة خنزير الجسم الحي السابق أو EVPL، الأغشية الحيوية من P.aeruginosa وS.aureus إظهار زيادة التسامح مع المضادات الحيوية بالمقارنة مع قابلية في معيار، وافقت الصناعة مرق هيئة التصنيع العسكري وأقراص المقايسات باستخدام وسائل الإعلام القياسية. الآثار المختلفة للمضادات الحيوية المختلفة على بيو فيلم EVPL المنشأة يمكن تمييزها.
على سبيل المثال، يتم تحقيق قتل P.aeruginosa في EVPL مع 4 إلى 16X هيئة التصنيع العسكري ciprofloxacin، ولكن ليس مع 4 إلى 8X هيئة التصنيع العسكري الكلورامفينيكول. مجموعات S.aureus المعرضة للخطوط في فحص القرص قادرة على البقاء على قيد الحياة تركيزات المصل المستهدف وأعلى في EVPL. حتى المقايسة المحسنة في المختبر لا يمكن التنبؤ بدقة بقابلية P.aeruginosa للكوليستين في EVPL.
كمية المضادات الحيوية المطلوبة لتحقيق ثلاثة سجل 10 قتل البكتيريا التي تزرع EVPL غالبا ما تكون أعلى بكثير من هيئة التصنيع العسكري أو MBEC محسوبة من المقايسات القياسية في المختبر. بالإضافة إلى التمييز بين العوامل المضادة للميكروبات، يمكن لهذا النموذج تسليط الضوء على التغيرات في قابلية في مراحل النمو البكتيرية المختلفة وفترات مختلفة المضادات الحيوية ال دوسينج. يظهر هنا التسامح المتزايد للأغشية الحيوية P.aeruginosa إلى ميروبينيم عندما تنضج.
تم قياس بقاء S.aureus على قيد الحياة في 4 و 24 ساعة بعد التعرض للفلوكلوكساسيلين ، مما يجعل من الممكن ملاحظة الاختلافات في تقليل عدد الخلايا البكتيرية عبر الزمن وبين العزلات. الاختلافات في الحمل البكتيري غالبا ما تزيد مع تمديد أوقات الثقافة. ويمكن رؤية ذلك في السيطرة غير المعالجة بعد تطوير بيو فيلم على مدار 48 ساعة والتعرض على مدار 24 ساعة أخرى لحساب الفاصل الزمني ل تناول المضادات الحيوية.
من المهم الحفاظ على تقنية معقمة ممتازة طوال فترة التشريح ، لذلك نوصي بإجراء التشريح في المختبر أو في منطقة من المختبر لا تستخدمها أبدا في أعمال علم الأحياء المجهرية. استخدمنا مؤخرا هذا النموذج لاستكشاف دخول الكوليستين إلى بيو فيلم، والنموذج لديه إمكانات جيدة للاستخدام في البحوث لتحسين تسليم الأدوية إلى الأغشية الحيوية.
نظرة عامة
يمكن هذا السير الذاتية اختبار حساسية المضادات الحيوية باستخدام نموذج ex vivo لفيلم بكتيري في رئتي التليف الكيسي. يعزز النموذج الصلاحية السريرية لاختبارات MBEC.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأحياء الدقيقة
- علم الأدوية
- البحث الطبي الحيوي
الخلفية
- يؤدي التليف الكيسي إلى التهابات رئوية مزمنة تتميز بتكوين فيلم بكتيري.
- قد لا تعكس طرق اختبار حساسية المضادات الحيوية الحالية سلوك فيلم البكتيريا بدقة.
- توفر نماذج ex vivo منصة أكثر ملاءمة لدراسة الالتهابات البشرية.
- يتم تقليل المخاوف الأخلاقية من خلال استخدام الرئتين من صناعة اللحوم.
هدف الدراسة
- لتطوير طريقة لاختبار حساسية المضادات الحيوية في الأفلام البكتيرية لرئتي التليف الكيسي.
- للتحقق من صحة النموذج ex vivo لفحص العقاقير المرشحة.
- لتعزيز فهم فعالية المضادات الحيوية ضد الأفلام البكتيرية.
الطرق المستخدمة
- عزل الأنسجة القصبية من الرئتين التي تم الحصول عليها بعد الذبح.
- إصابة الأنسجة بالسلالات البكتيرية لتكوين الأفلام البكتيرية.
- الحضانة والمعالجة بمختلف المضادات الحيوية.
- تقييم نمو البكتيريا وتحمل الفيلم البكتيري من خلال عد وحدات تشكيل المستعمرات.
النتائج الرئيسية
- تظهر الأفلام البكتيرية P.aeruginosa وS.aureus تحملًا متزايدًا للمضادات الحيوية في النموذج ex vivo.
- تظهر المضادات الحيوية المختلفة فعالية متفاوتة ضد الأفلام البكتيرية المستقرة.
- تشير النتائج إلى إمكانية اختبار حساسية فردية للمضادات الحيوية.
- يظهر النموذج اختلافات كبيرة مقارنةً باختبارات MIC المحلول المعياري.
الاستنتاجات
- يعتبر النموذج ex vivo أداة واعدة لدراسة فعالية المضادات الحيوية ضد الأفلام البكتيرية لرئتي التليف الكيسي.
- قد تؤدي التحقق الإضافي إلى تحسين طرق الاختبار السريرية.
- قد يسهل هذا النهج تطوير علاجات موجهة لمرضى التليف الكيسي.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Standard antibiotic susceptibility testing (AST) methods often fail to predict clinical outcomes in cystic fibrosis (CF) lung infections due to their inability to replicate the in vivo biofilm environment. The ex vivo pig lung (EVPL) model provides a more physiologically relevant platform for evaluating antibiotic efficacy against mature biofilms of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. This approach enhances predictive confidence for drug discovery and supports risk-adjusted portfolio decisions in anti-infective R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of antibiotic action within disease-relevant biofilm architecture.
- Supports biological de-risking by revealing true tolerance profiles of clinical isolates.
- Improves predictive confidence for candidate selection and triage in anti-infective pipelines.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of in vivo-like biofilm systems for robust compound screening.
- Enables quantitative, reproducible measurement of bacterial survival post-treatment.
- Supports assay standardization and platform reuse for diverse antibiotic classes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns susceptibility testing with disease-relevant conditions found in CF lungs.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of antibiofilm agents.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on clinically relevant efficacy data.
Pipeline & Workflow Integration
The EVPL model bridges early discovery and preclinical validation by providing a platform that mimics the CF lung environment for antibiotic efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on antibiotic penetration and action in mature biofilms.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation against biofilm-embedded bacteria.
- Analytics: Enables measurement of log reductions in bacterial load and comparison across antibiotics and dosing intervals.
- Translational Research: Aligns in vitro findings with in vivo-like conditions, improving translational continuity.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, scalable platform for ongoing anti-infective R&D and bespoke patient sample testing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in antibiotic efficacy studies.
- Operational Value: Standardizes susceptibility testing in a physiologically relevant context with scalable workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in anti-infective portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of antibiofilm candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile tissue dissection and biofilm microbiology.
- Needs access to pig lungs, synthetic CF sputum, and standard microbiology instrumentation.
- Demands rigorous cross-team standardization of tissue preparation and assay conditions.
- Adaptation may be needed for different pathogens or model systems.
- Practical limitations include tissue sourcing logistics and model throughput.
