وصف رسم الخرائط 3D للخلية بواسطة التصوير المقطعي بالأشعة السينية الناعمة Cryo

يمكن أن يوفر التصوير المقطعي بالأشعة السينية الناعمة Cryo معلومات كمية قيمة على المستوى الخلوي يمكن استخدامها كمستقل أو مقترن بتقنيات التصوير الأخرى. صورة المستشعر في حالة رطبة مجمدة تحتاج إلى تلطيخ أو تقسيم. بالإضافة إلى ذلك ، إنها تقنية عالية الإنتاجية ، لأنه يتم جمع كل تصوير مقطعي في بضع دقائق فقط.

يوفر التصوير المقطعي بالأشعة السينية الناعمة منصة مثالية لمتابعة عملية استعادة الخلايا في الخلايا المصابة أو المعيبة على مستوى الخلية الواحدة. يمكن لهذه التقنية الإبلاغ عن فعالية الأدوية المضادة للفيروسات الجديدة أو العلاج الجيني لعكس عدوى الأنماط الظاهرية المنقوصة. لتحميل العينات في مجهر الأشعة السينية الناقل ، قم بتبريد غرفة النقل بالنيتروجين السائل حتى تصل إلى أقل من 100 كلفن.

املأ محطة العمل بالنيتروجين السائل الإضافي وقم بتشغيل سخان حافة محطة العمل. عندما تتوقف حافة محطة العمل عن الغليان، ضع صندوق التبريد الذي يحتوي على شبكات في المواقع المناسبة في محطة العمل تحت ظروف التبريد وقم بتحميل الشبكات على حاملات العينات التي تم تبريدها مسبقا. قم بتحميل الحاملات على المكوك وحمايتها بالأغطية.

قم بتحميل المكوك في غرفة النقل عند أقل من 100 كلفن وضخ الغرفة إلى فراغ منخفض. قم بتوصيل غرفة النقل بالمجهر واتبع إجراء التفريغ على الشاشة لتحميل مكوك غرفة النقل في المجهر. بمجرد أن يكون المكوك في المجهر مع العينات ، استخدم ذراع روبوت المجهر لنقل حامل عينة واحد إلى مرحلة العينة.

للحصول على تصوير ساطع للشبكة باستخدام مجهر الضوء المرئي عبر الإنترنت ، حدد كاميرا مجهر الضوء المرئي وقم بتشغيل مصدر LED لمجهر الضوء المرئي للتصوير الساطع. انقر فوق الحركة والتحكم والعينة والعينة theta لتدوير العينة إلى ناقص 60 درجة بحيث تواجه هدف مجهر الضوء المرئي ، وحدد التحكم في الحركة والعينة وقم بتغيير العينة X والعينة Y لنقل العينة إلى المواضع المركزية المتوقعة. حدد المجهر والاستحواذ وإعدادات الاقتناء وأوضاع الاقتناء والمستمر وابدأ وانقر فوق التحكم في الحركة والعينة لتحديد العينة Z لتحسين التركيز البؤري بخطوات أصغر وصولا إلى خمسة ميكرون حتى تكون الخلايا و / أو ثقوب فيلم دعم الكربون في بؤرة التركيز.

ثم حدد المجهر والاستحواذ وإعدادات الاستحواذ وأوضاع الاستحواذ والفسيفساء والبدء في الحصول على خريطة فسيفساء كاملة للشبكة في وضع الحقل الساطع باستخدام القيم الافتراضية للفسيفساء. بالنسبة للتصوير الفسيفسائي في وضع التألق، قم بإيقاف تشغيل مصدر LED لمجهر الضوء المرئي للتصوير الساطع وحدد مصدر ضوء LED المقابل للطول الموجي للإثارة المطلوب والمرشح البصري المقابل يدويا عند الإعداد. حدد المجهر والاكتساب وإعدادات الاكتساب وأوضاع الاكتساب والمستمر وابدأ وانقر فوق التحكم في الحركة والعينة لتحديد العينة Z لتحسين التركيز على صورة التألق.

ثم انقر فوق المجهر ، والاستحواذ ، وإعدادات الاستحواذ ، وأوضاع الاستحواذ ، والفسيفساء ، وابدأ في الحصول على خريطة فسيفساء تحتفظ بمعلمات X و Y الموضعية من فسيفساء brightfield. ثم قم بإيقاف تشغيل مصدر ضوء LED. للحصول على فسيفساء الأشعة السينية ، قم بتغيير شق الخروج إلى خمسة ميكرون واستخدم التعرض لمدة ثانية واحدة في MISTRAL.

حدد المجهر والاكتساب وإعدادات الاكتساب وإعدادات الكاميرا والربط لضبط التركيز البؤري باستخدام ترجمة Z النموذجية. حدد التحكم في الحركة والعينة لتحديد العينة Z.بدءا من خطوات خمسة ميكرون، قم بتحسين التركيز البؤري وصولا إلى خطوات 0.5 ميكرون حتى تصبح الخلية أو ثقوب رقائق الكربون في بؤرة التركيز البؤري بشكل جيد. للحصول على خريطة فسيفساء لمربع الشبكة، انقر فوق المجهر والاستحواذ وإعدادات الاستحواذ ووضع الاستحواذ والفسيفساء والبدء.

عند الحصول على الخريطة، انقر فوق التحكم في الحركة والعينة وقم بتغيير العينة X والعينة Y لنقل العينة إلى موضع حقل مسطح. اضبط وقت التعرض على ثانية واحدة في MISTRAL. ثم ، تطبيع الفسيفساء المكتسبة بواسطة صورة الحقل المسطح للحصول على الإرسال وحفظ الفسيفساء الطبيعية.

لمحاذاة العينة على محور الدوران مع الدوران عند صفر درجة، حدد التحكم في الحركة والعينة وقم بتغيير العينة X والعينة Y والعينة Z للتركيز على ميزة الخلية لوضعها على محور الدوران. لتدوير العينة إلى موضع ثيتا موجب، حدد التحكم في الحركة والعينة وقم بتغيير عينة ثيتا إلى ثيتا موجبة. استخدم أداة الخط لرسم خط على ميزة الخلية لوضعها على محور الدوران.

لتدوير العينة إلى موضع ثيتا سالب، حدد التحكم في الحركة والعينة وقم بتغيير عينة ثيتا إلى ثيتا سالبة. استخدم أداة الخط لرسم خط على ميزة الخلية لوضعها على محور الدوران. أثناء وجودك في موضع ثيتا موجب أو سالب، استخدم ترجمة العينة Z لنقل المعلم المحدد إلى موضع المركز بين كلا الخطين وكرر دوران العينة حتى يتم الحصول على الحد الأدنى من المسافة من خط إلى خط.

عندما تساوي عينة ثيتا صفرا، حرك العينة X ضعف المسافة اللازمة لوضع المعلم المحدد في مركز مجال الرؤية، وحرك لوحة المنطقة X لإعادة المعلم إلى مركز مجال الرؤية. لإعادة تحسين موضع لوحة المنطقة Z فيما يتعلق بمحور الدوران الجديد، حدد المجهر وإعدادات الاستحواذ وأوضاع الاستحواذ والسلسلة البؤرية وانقر فوق ابدأ لتسجيل سلسلة بؤرية Z للوحة المنطقة. ثم انقر فوق التحكم في الحركة ولوحة المنطقة وحدد لوحة المنطقة Z لنقل لوحة المنطقة Z إلى الموضع الذي تكون فيه العينة في بؤرة البؤرة.

للحصول على تصوير مقطعي، انقر فوق التحكم في الحركة والعينة وحدد عينة ثيتا لنقل الزاوية القصوى السالبة إلى زائد 0.1. انقر فوق المجهر ، وإعدادات الاستحواذ ، وأوضاع الاستحواذ ، والتصوير المقطعي لتعيين عدد الصور كإجمالي عدد الزوايا ، مع مراعاة الصورة عند الزاوية صفر والنطاق الزاوي ، وتعيين عدد الصور. حدد بدء الزاوية ونهاية الزاوية، وانقر فوق المجهر، والاستحواذ، وإعدادات الاستحواذ، وإعدادات الكاميرا، واضبط وقت التعريض الضوئي.

انقر فوق ابدأ لبدء اقتناء سلسلة إمالة التصوير المقطعي. يجب أن تحتوي العينة المثالية على خلايا مفردة في وسط شبكة مربعة مدمجة في طبقة رقيقة من الجليد ومحاطة بعلامات ائتمانية ذهبية مشتتة جيدا. يجب أن تكون العديد من العضيات المختلفة ، مثل الميتوكوندريا ، وشبكية الاندوبلازما ، والفجوات ، والنواة قادرة على التمييز في التصوير المقطعي النهائي الذي أعيد بناؤه ، وذلك بفضل إعادة البناء الكمي لمعاملات الامتصاص الخطي.

في هذه الصورة ، يمكن ملاحظة مربع بكثافة خلية أعلى. في هذا المثال ، كان النشاف أقل كفاءة ، مما أدى إلى طبقة جليدية أكثر سمكا مع تشققات. على الرغم من أنه يمكن التعرف على بعض الهياكل الكبيرة في هذا التحضير ، فقد فقدت التفاصيل الدقيقة داخل الضوضاء والملمس المحبب بسبب ضعف جودة التزجيج للجليد السميك.

يجب التعامل مع العينة المحفوظة بالتبريد إلى الحد الأدنى ، حيث يتم تحفيز معظم القطع الأثرية عند العينات في هذه المرحلة. عادة ، المجهر الضوئي المرئي بالتبريد المرتبط ، تستخدم التصوير المقطعي قبل الركيزة المبردة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء الفحص المجهري الطيفي في العناصر الكيميائية ذات الصلة.

يملأ هذا البروتوكول مكانة من خلال العمل في نظام العينات والدقة ، والتي لا يمكن الوصول إليها بسهولة من خلال أي تقنية تصوير مباشر أخرى ، مما يسمح بعدد قليل من الميكرونات ودقة نصف الملعب 30 نانومتر.