تقدير البلورات النانوية البولية في البشر باستخدام تسمية فلوروفور الكالسيوم وتحليل تتبع الجسيمات النانوية

يمكن لهذا البروتوكول الكشف على وجه التحديد عن البلورات النانوية المحتوية على الكالسيوم في بول الإنسان. يمكن أن تكون هذه التقنية مفيدة للتنبؤ بالمراحل المبكرة من تكوين حصى الكلى وكذلك الأمراض الأخرى المرتبطة باليوريا البلورية. إثبات الإجراء سيكون الدكتور بارفين كومار، الباحث الرابع في مختبري.

هل لديك المشاركين تستهلك اتباع نظام غذائي منخفض أوكسالات لمدة ثلاثة أيام وسريع بين عشية وضحاها. ثم جمع عينة البول على مدار 24 ساعة من المشاركين قبل أن يكون لهم تستهلك حمولة أوكسالات. إطعام المشاركين مع عصير يحتوي على الفواكه والخضروات وجود حمولة أوكسالات من حوالي ثمانية ملليمول.

يجب على المشاركين جمع البول لمدة 24 ساعة بعد استهلاك الأوكسيالات وإعادته في اليوم التالي. الحفاظ على جميع عينات البول في درجة حرارة الغرفة قبل المعالجة. قياس وتسجيل درجة الحموضة البول وحجم عينات البول.

تخلط جيدا وإضافة 50 ملليلتر من البول في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر معقم المسمى. طرد مركزي العينة في 1, 200 مرات G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة باستخدام جهاز طرد مركزي مقاعد البدلاء أعلى. تجاهل supernatant، ثم غسل وإعادة إنفاق بيليه مرة أخرى مع خمسة ملليلتر من الإيثانول 100٪.

طرد مركزي العينة في 1, 200 مرات G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة باستخدام جهاز طرد مركزي مقاعد البدلاء أعلى. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه في ملليلتر واحد من الإيثانول 100٪. تخزين العينة في ناقص 20 درجة مئوية للمعالجة في وقت لاحق أو المضي قدما على الفور مع تلطيخ العينات.

تمييع 100 نانومتر نانومتر نانومتر في المياه فائقة التفريغ بنسبة 1:1،000 واستخدامها لتحسين الإعدادات على الصك. تمييع عينات البول 20 مرة في الماء قبل تلطيخ مع خمسة ملليمولار فلو-4 AM لمدة 30 دقيقة في الظلام وتحليل العينات باستخدام NTA. إعداد بلورات أوكسالات الكالسيوم وفوسفات الكالسيوم كما هو موضح في المخطوطة النصية قبل تحليل NTA.

قم بتشغيل الكمبيوتر والأدوات، ثم افتح البرنامج ثم قم بتشغيل الكاميرا. انقر فوق رمز الالتقاط في الزاوية العلوية اليسرى من النافذة لبدء وضع الالتقاط. تنظيف المنصة عن طريق ضخ الهواء لأول مرة في ذلك باستخدام حقنة ملليلتر واحد حتى تظهر المنصة نظيفة.

أضف الماء برفق إلى الجهاز مرتين إلى ثلاث مرات واستخدم حقنة ملليلتر أخرى لإزالة أي فقاعات هوائية. بمجرد أن تكون المنصة نظيفة ، أضف الماء وتحقق من أي تلوث على السطح عن طريق عرض الكاميرا ، ثم أضف الجسيمات النانوية الذهبية كتحكم في حاقن مضخة تحميل العينة لإعداد الأداة. ضبط مستوى الكاميرا على الشاشة أو على مقبض الباب إلى الجانب الأيمن من الصك حتى تبدأ الصورة لعرض بكسل الملونة، ثم تقليل مستوى الكاميرا.

بعد ذلك، قم بضبط الشاشة لتحسين الصورة. اليسار انقر على زر الماوس على صورة الفيديو. اضغط على زر الماوس الأيسر واسحب الصورة لأعلى ول لأسفل للحصول على العرض بالكامل.

قم بإعداد سرعة التسريب وركز الكاميرا بحيث تكون الجسيمات النانوية الذهبية مرئية على شاشة الكاميرا. تعيين سرعة التسريب إلى عالية لإعداد الأولي لضمان الكشف عن الجسيمات النانوية الذهب. بمجرد اكتشافها، قم بتقليل السرعة إلى 50 ميكرولتر في الدقيقة لتصور الجسيمات النانوية الذهبية.

ضبط مستوى الكاميرا لتصور الجسيمات. للعينات غير الملطخة، قم بضبط كسب الشاشة عند المستوى الخامس لتحقيق تركيز الكاميرا وحدد مستوى الكاميرا بثمانية. بمجرد تعيين التركيز، سجل العينة.

بعد التحسين، تنظيف الجهاز مرة أخرى بالماء قبل تقييم عينات أخرى لضمان أن الأنابيب نظيفة والجسيمات غير موجودة. لتحليل عينات ملونة، ضبط الكاميرا إلى موقف مرشح يحتوي على مرشح الفلورسنت مناسبة وتحميل عينات مخففة وملطخة على حاقن مضخة تحميل العينة، والحد من السرعة إلى 20 ميكرولتر في الدقيقة للتحليل. ضبط كسب الشاشة إلى خمسة ومستوى الكاميرا إلى 13.

حفظ البيانات بعد كل قياس. حساب متوسط عدد الجسيمات النانوية لجميع القراءات الخمس لكل عينة على حدة وتحليل البيانات باستخدام الانحراف المعياري أو الخطأ المعياري للوسط. استخدم T-الاختبارات للتحليل المقترن.

وتمكنت فلو-4 إيه أم من الربط بكل من بلورات أوكسالات الكالسيوم، التي يتراوح حجمها بين 50 و270 نانومتر، وكان متوسط تركيزها 1260 مليون جسيم لكل ملليلتر، وبلورات فوسفات الكالسيوم، التي كانت تتراوح بين 30 و225 نانومتر وكان متوسط تركيزها 220 مليون جسيم لكل ملليلتر. تحتوي عينات البول التي تم جمعها على مدار 24 ساعة قبل حمل الأوكسيالات على بعض البلورات النانوية البولية التي يتراوح حجمها بين 110 إلى 300 نانومتر. وعلى النقيض من ذلك، كانت هناك زيادة كبيرة في البلورات النانوية البولية الموجودة في عينات ما بعد الأوكسيالات.

ولتأكد من إمكانية استنساخ هذه الطريقة، قيست العينات ثلاث مرات ولم يكن هناك تباين كبير في النماذج التقنية المتماثلة. عند محاولة هذا البروتوكول، قد يكون هناك بعض الصعوبة في إضافة عينات بدون فقاعات إلى الجهاز. لمنع ذلك، أضف الهواء والماء إلى الجهاز، ثم أضف عينات ببطء.

أيضا، تأكد من مراقبة العينات الخاصة بك باستمرار وأنه لا توجد فقاعات موجودة. وسيتم اختبار هذه الطريقة الجديدة في الأفراد الذين يعانون من مرض الكلى أوكسالات الكالسيوم لرصد تطور المرض و / أو للتنبؤ خطر حصى الكلى.