التوصيف الوظيفي للمتغيرات RYR1 البشرية المعبر عنها داخليا

هذا البروتوكول مهم لأنه يستخدم مواد المريض. إذا كان المريض يعاني من المرض ، فإن استخدام خلاياه يجب أن يعكس بشكل أكثر دقة الاستجابة البيولوجية للمريض. هذه التقنية بسيطة الأداء ومباشرة ولا تتطلب معدات متطورة.

يمكن استخدام هذه الطرق للتشخيص ، على سبيل المثال ، لإثبات أن طفرة RYR1 تغير وظيفيا التوازن الكالسيوم ، وكذلك لاختبار الوظيفة العلاجية المحتملة للمجمع. اعتمادا على المعرفة والمهارات التقنية للباحث الفرد ، يجب إجراء تجارب الاختبار قبل استخدام عينات المريض الفعلية. لرصد التغيرات في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا من الخلايا الليمفاوية B التي تحولت EBV، resuspend الخلايا B الخالدة في مرة واحدة 10 إلى الخلايا السابعة لكل تركيز ملليلتر في محلول كريبس رينغر وفورا-2 صباحا إلى تركيز نهائي من خمسة ميكرومولار لاحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.

في نهاية الحضانة، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي، وإعادة إنفاق بيليه في محلول كريبس رينغر الطازجة في مرتين 10 إلى الخلايا السادسة لكل تركيز ملليلتر. قبل بدء التجربة مباشرة، طارد مركزي الخلايا مرة أخرى، وبسرعة إعادة إنفاق الخلايا في 1.5 ملليلتر من محلول كريبس رينغر تكملها 0.5 ملليمولار EGTA ولكن لا الكالسيوم المضافة. نقل الخلايا إلى الزجاج، وثلاثة ملليلتر الطيفية cuvette، وتسجيل نسبة الفلورية على مقياس الطيف مجهزة stirrer المغناطيسي تعيين في السرعة القصوى و 37 درجة مئوية لمدة 30 ثانية تقريبا.

لتقييم استجابة إطلاق الكالسيوم في خلايا واحدة ، لوحة واحدة مرة واحدة 106 Fura-2 AM الخلايا المحملة في ملليلتر واحد من محلول كريبس رينغر تكملها كلوريد الكالسيوم ميليمولار واحد على الفردية بولي L-lysine زلات الغطاء الزجاجي المغلفة ، واحتضان الغطاء ينزلق في 37 درجة مئوية في حاضنة ثقافة الخلية الرطبة لمدة 30 دقيقة. عندما تعلق الخلايا، ضع زلة غطاء في غرفة التشوه، وابدأ في تغلغل الخلايا في ملليلترين من محلول كريبس رينغر المكمل بالكالسيوم أحادي الميليمولار لكل معدل تدفق دقيقة. باستخدام مجهر فلوري مقلوب مجهز بهدف غمر الزيت 40 مرة والمرشحات المناسبة ، سجل القياسات عبر الإنترنت مع مرفق كاميرا جهاز يتم التحكم فيه بواسطة البرامج ، مقترن بالشحن على فترات ثانية واحدة ، في وقت تعرض ثابت.

لتحقيق تحفيز الخلايا، استخدم محفز تغلغل الخلية مع 12 صماما لإضافة تركيزات مختلفة من ناهض. لعزل myotubes من خزعات العضلات البشرية، أولا شطف الخزعة مع برنامج تلفزيوني عقيم لإزالة أي دم زائد قبل الفقط الأنسجة إلى شظايا صغيرة، 0.5 إلى ملليمتر واحد. ضع جزءين إلى ثلاثة أجزاء في إدراج فردي في كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة ذات الست آبار التي تحتوي على 1.5 ملليلتر من متوسط نمو العضلات البشرية لكل بئر و500 ميكرولتر من المتوسط لكل إدراج ، ووضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية.

لقياس التغيرات في التعبير عن الكالسيوم في الميوتوبات البشرية ، عندما يمكن ملاحظة الميوتوبات متعددة النوى ، استبدل مغذيات ثقافة الميوتوب بوسط تمايز جديد مكمل ب 10 ميكرولترات من Fura-2 AM من ملليمولار واحد لاحتضان لمدة 30 دقيقة في حاضنة ثقافة الخلية. في نهاية الحضانة، نقل غطاء زجاجي واحد زلة الثقافة إلى غرفة التشوه، وشطف الخلايا مع محلول كريبس رينغر تكملها كلوريد الكالسيوم اثنين ملليمولار. ثم إجراء قياسات الكالسيوم عبر الإنترنت كما هو موضح باستخدام هدف غمر الماء 20 مرة.

في هذا التحليل التمثيلي ، لوحظت زيادة سريعة في الكالسيوم في الخلايا الليمفاوية B التي خلدها EBV بعد إضافة ناهض انخفض ببطء إلى مستويات الراحة بمرور الوقت. وفي تجربة مماثلة، تسببت إضافة 400 نانومولار رابسيغارجين في حدوث عملية عابرة كبيرة للكالسيوم وصلت إلى ذروة قيمة الفلورية البالغة 2.4 وحدة اعتباطية. واعتبرت هذه القيمة الفلورية أن تكون 100٪ عندما تم بناء منحنى الاستجابة الجرعة المقابلة.

في هذا التحليل، تم تحفيز الخلايا B الخالدة مع الكافيين خمسة ملليمولار لمدة 20 ثانية، مما أدى إلى زيادة فورية في نسبة الفلورية 340 و 380 نانومتر. لكل تركيز الكافيين اختبارها, تم حساب الذروة الناجمة عن الكافيين في نسبة 340 من قبل 380 نانومتر من الفلورسينس واستخدامها لبناء منحنى استجابة الجرعة. يمكن أيضا تقييم إطلاق الكالسيوم من الميوتوبات المتمايزة استجابة للتدفق مع كلوريد البوتاسيوم ، وتركيزات مختلفة من ناهض ، و / أو الكافيين ، ويمكن توليد منحنيات استجابة الجرعة العادية.

من المهم التأكد من أن الخلايا يتم تحميلها بشكل صحيح مع Fura-2 وأن كلا من الأطوال الموجية 340 و 380 نانومتر تستجيب لإضافة ناهض. يمكن فحص قياسات الكالسيوم داخل الخلايا مع مؤشرات الكالسيوم الفلورية في معظم خلايا الثدييات ويمكن تطبيقها على دراسة تغيرات الكالسيوم داخل الخلايا استجابة للمحفزات المختلفة.