TGF-β بوساطة البطانية إلى الانتقال المتوسط (EndMT) والتقييم الوظيفي لمؤثري EndMT باستخدام CRISPR/Cas9 تحرير الجينات

إن الانتقال البطاني إلى المتوسط هو عملية خلوية تقوم فيها الخلايا البطانية بتغيير مورفولوجيا الحصى إلى نمط فينوتيب يشبه الخلايا الليفية. والسيتوكين TGF بيتا، تحويل عامل النمو بيتا، هو المحرك الرئيسي لهذا التحول. تحليل التغيرات في مورفولوجيا الخلايا ومستويات التعبير من علامات البطانية و mesenchymal يسمح لنا لتقييم حدوث الانتقال البطانية إلى المتوسطة.

تربط البيانات الناشئة عملية الانتقال البطانية إلى الأمراض المختلفة بما في ذلك السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية والتليف. وتشير البيانات إلى أن التدخل قد يكون ذا فائدة علاجية. من خلال تحفيز عملية الانتقال البطانية إلى المتوسطة ، والتي تحدث أثناء تكوين الجنين وتطور الأعضاء ، قد نكون قادرين على تجديد الأنسجة المشتقة من الميكنشيمال مثل الغضاريف والعظام والعضلات.

للكشف عن البروتين داخل الخلايا عن طريق تلطيخ immunoflourescence، permeabilization الخلية باستخدام 0.1٪ تريتون X-100 ضروري للسماح للأجسام المضادة لتمرير من خلال أغشية الخلايا. مع هذا العرض التوضيحي الفيديو، وسوف يحصل الباحثون على فهم جيد لكيفية التحقيق في دور السيتوكينات مثل TGF-بيتا في الانتقال البطانية إلى المتوسطة. أولا، البذور 1 × 10 ^5 يعكس خلايا MS1 البطانية الجزيرة البنكرياس في DMEM تكملها 10٪ FBS و 100 وحدة لكل ملليلتر من البنسلين والستربتوميسين على لوحة ثقافة 0.1٪ الجيلاتين المغلفة.

بعد الحضانة بين عشية وضحاها في حاضنة ثقافة الخلية، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني قبل علاج مع اثنين من ملليلتر من 0.25٪ تريبسين، 0.02٪ حل EDTA لمدة دقيقتين في 37 درجة مئوية. عندما تبدأ الخلايا في الانفصال ، قم بإرواء التفاعل بخمسة ملليلترات من وسيط الثقافة الكامل ونقل تعليق الخلية الناتج إلى أنبوب 15 ملليلتر للطرد المركزي. Resuspend بيليه في أربعة ملليلتر من المتوسطة كاملة جديدة للعد.

والبذور 1 × 10 ^ 3 خلايا لكل سنتيمتر مكعب في حاوية جديدة ثقافة الخلية. بعد الثقافة بين عشية وضحاها، علاج اثنين من الآبار مع خمسة ميكرومولار TGF بيتا مستقبلات كيناز المانع SB-431542 واثنين من الآبار مع التحكم في المذيبات DMSO. ووضع الخلايا في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 30 دقيقة.

في نهاية الحضانة، عالج بئرين بالتحكم في السيارة وبأبارين باستخدام TGF-beta 2. بعد ثلاثة أيام، استخدم مجهر مقلوب لفحص مورفولوجيا الخلية لكل مجموعة علاج خلايا تحت التصوير الساطع. لتقييم التغيرات ذات الصلة بعلامة endMT عن طريق تلطيخ immunofluorescent ، فصل الخلايا من ثقافة الخلية MS1 المناسبة ، كما هو موضح.

والبذور الخلايا في 1.9 X 10 ^ 3 تركيز الخلايا على 0.1٪ الجيلاتين المغلفة 12 ملليمتر نظارات تغطية مستديرة وضعت داخل الآبار الفردية من لوحة 24 جيدا. بعد الثقافة بين عشية وضحاها، علاج الخلايا مع ملليلتر نانوغرام واحد من TGF-بيتا 2 لمدة ثلاثة أيام. في نهاية الحضانة، اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني وأصلح الثقافات المعالجة ب 300 ميكرولتر من 4٪ فورمالديهايد لكل بئر لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

في نهاية التثبيت، اغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني قبل permeabilizing الخلايا مع 300 ميكرولتر من 0.1٪ تريتون X-100 وبرنامج تلفزيوني لكل بئر لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، اغسل الخلايا ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني ومنع الخلايا مع 3٪ BSA في برنامج تلفزيوني. بعد 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، قم بتسمية الخلايا بالأجسام المضادة PECAM-1 و SM22-alpha الأساسية لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، تليها ثلاث يغسل في برنامج تلفزيوني.

بعد الغسيل الأخير ، احتضن الخلايا بالأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، واغسل الخلايا ثلاث مرات مع PBS قبل تركيب الخلايا مع وسيط تصاعد تكمله DAPI وزلة غطاء. ثم ختم حواف الغطاء زلة مع طلاء الأظافر واضحة وصورة التعبير علامة الخلية عن طريق المجهر confocal مضان باستخدام المرشحات المناسبة وفقا لبروتوكولات التصوير القياسية. بعد ثلاثة أيام من العلاج مع TGF-beta 2 ، تفقد خلايا MS1 البطانية بنيتها الشبيهة بالحصى وتفرق إلى خلايا تشبه المغزل.

يتم قمع هذا التمايز الناجم عن TGF-beta 2 عندما تتعرض الخلايا لمثبط كيناز مستقبلات TGF-beta SB-431542. يتم تقليل التعبير عن البروتين البطاني PECAM-1 بقوة بعد تحفيز TGF-beta 2 في حين أن العامل المتوسط SM-22 alpha منظم بشكل عميق. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تنظيم الحلزون بشكل ملحوظ من قبل التعرض TGF بيتا 2 في حين لا يتأثر التعبير سبيكة.

كما لوحظ CRISPR-Cas9 تحرير الجينات يمكن استخدامها لتسهيل إدخال اثنين من الحلزون دليل واحد مستقل RNAs في Cas9 التعبير عن خلايا MS1 لتعطيل التعبير الحلزون. خروج المغلوب من الحلزون كافية لمنع مورفولوجيا الخلايا الليفية مثل مدفوعة TGF بيتا 2 في خلايا MS1 ومنع TGF-بيتا 2 بوساطة PECAM-1 الانخفاض وتعزيز SM-22 ألفا. يمكن التحقق من صحة تقييم التغيرات في مورفولوجيا الخلايا والتعبير عن العلامات البطانية والميدنشيمالية عن طريق الفلورة المناعية من خلال قياس التعبير عن هذه العلامات على PCR الكمي في تحليل البقع الغربية.

وقد سمحت هذه التقنية للكشف عن الانتقال البطانية إلى المتوسطة للباحثين للتحقيق في هذه الأهمية الناشئة كعملية فسيولوجية تحدث في أمراض متعددة.