مجموعة بيانات تسلسلية هدف ثابت في مصدر ضوء الماس
فبراير 26, 2021
نقدم دليلا شاملا لإعداد عينة الهدف الثابت، وجمع البيانات، ومعالجة البيانات للبلورات السنكروترون المسلسل في الماس الحزمة I24.
المسلسل البلورات السنكروترون ، أو SSX ، هو مجال جديد نسبيا وسريعة التطور من MX.It مناسبة تماما لجرعة منخفضة وتجارب درجة حرارة الغرفة ، ولكن ربما الأهم من ذلك ، انها حقا مناسبة تماما لديناميات التالية. وهذا يسمح للأفلام وقف الحركة من البروتينات في العمل التي يتعين القيام بها. في I24، تتوفر أوضاع متعددة من SSX.
يركز هذا البروتوكول على SSX ذات الهدف الثابت، والتي تسمح بمجموعة واسعة من التجارب التسلسلية باستخدام كميات محدودة من العينة. يمكن أن تتلف رقائق السيليكون عند تحميلها وتنظيفها ، إذا كنت غير مألوف بها. أيضا ، بروتوكول محاذاة رقاقة جديدة تماما لكثير من crystallographers ، ومعالجة البيانات يختلف قليلا عن البيانات الخاصة بك دوران القياسية.
لإعداد حامل رقاقة، وقطع ورقتين من رقائق البوليستر إلى ما يقرب من 6 في 6 سم مربع، ووضع الأوراق على لوحات قاعدة اثنين. باستخدام حلقات ختم معدنية، وإصلاح الأوراق في مكان، ثم سحب بعناية على احباط الزائدة لإزالة أي التجاعيد. بعد ذلك ، حدد رقاقة السيليكون ذات الفتحات المناسبة الحجم بالنسبة لحجم البلورات التي سيتم تحليلها.
توهج تفريغ رقاقة لمدة 25 ثانية في 0.39 ملليبار، مع تيار 15 مللي أمبير. استخدام ملاقط لوضع رقاقة السيليكون على مرحلة تحميل رقاقة، مع القضبان التي أثيرت تواجه أسفل. ثم، وذلك باستخدام ماصة، وتطبيق 200 ميكرولتر من الطين microcrystal إلى الجانب المسطح من رقاقة، ونشر الطين لتغطية جميع كتل المدينة من رقاقة.
إذا تضررت رقاقة، وتغطية أي ثقوب مع قطعة صغيرة من رقائق البوليستر، لضمان أن فراغ حتى يمكن تطبيقها. ثم تطبيق فراغ لطيف لتنشق كل من السائل الزائد من خلال رقاقة. قم بإزالة الشريحة من مرحلة تحميل الشريحة، ولطخ بعناية الجانب السفلي من الشريحة بورق تصفية لإزالة السائل الزائد.
ضع الشريحة المحملة على النصف الأكبر من حامل الشريحة بين علامات الدليل ، الجانب المسطح لأسفل. ضع النصف الصغير من حامل الشريحة على الشريحة لختمها. يجب أن ينفجر نصفي حامل الشريحة في مكانه.
ثم، وذلك باستخدام مسامير هيكس، إصلاح رقاقة بأمان في مكان. لمحاذاة الشريحة، أمسك حامل الشريحة بزاوية 30 درجة أثناء الاقتراب من الحامل. ثم استخدم يتصاعد الحركية لوضع رقاقة محملة على المرحلة XYZ في خط شعاع.
عندما المغناطيس إجراء اتصال، والسماح لحامل رقاقة لتدوير موازية لتدفق، وانقر في مكانه. بمجرد وضع الشريحة ، استخدم نظام عرض الحزمة على المحور وواجهة المستخدم الرسومية لمحاذاة الشريحة لتحديد موقع أعلى fiducial الأيسر للشريحة. للتوسيط على fiducial 0 في X و Y و Z ، انتقل إلى داخل وخارج التركيز لمحاذاة Z ، صعودا وهبوطا لمحاذاة Y ، واليسار واليمين لمحاذاة X.Then انقر فوق Set Fiducial 0 "بعد محاذاة fiducial 1 و 2 مع شعاع الأشعة السينية بنفس الطريقة ، انقر فوق إنشاء نظام تنسيق" لتوليد مصفوفة تنسيق.
ثم انقر فوق "فحص كتلة" لنقل المرحلة XYZ إلى البئر الأول من كل كتلة المدينة. إذا كانت خطوط مرمى الأشعة السينية مع الفتحات، يتم محاذاة الشريحة. في هذا التمثيل الرسومي لنتائج البحث الفوري من DIALS يمكن ملاحظة مؤامرة معدل ضرب تحديث.
إذا تم النقر فوق ضربة، سيتم عرض صورة الحيود المقابلة في عارض الصور DIALS. في هذا الجدول، يمكن تصور معدلات الفهرسة والتكامل الحالية التي يتم تحديثها في الوقت الفعلي أثناء جمع البيانات أثناء الزيارة. يمكن أن يكشف التصور لمعلمات خلية الوحدة عن تعدد الأشكال.
ويمكن أيضا إنتاج مؤامرات ثنائية الأبعاد من المعلمات المفيدة للكشف عن الاختلافات التي تنشأ بسبب تحميل أو آثار الجفاف. يمكن أن تكشف الإسقاطات المجسمة عن وجود أو عدم وجود التوجهات المفضلة التي يمكن تغذيتها مرة أخرى في بروتوكول التحميل. على سبيل المثال، في هذا الإسقاط، يمكن ملاحظة آثار إثقال رقاقة مع بلورات lysozyme.
عند تحميل رقاقة، ماصة ببطء واستخدام إصبعك للراحة ماصة فوق رقاقة. هذا يمنعك من لمس رقاقة وطعن بطريق الخطأ ثقوب في السيليكون. عند معالجة البيانات، استخدم خطوط الأنابيب المؤتمتة المتاحة.
هذا وسوف تعطيك فكرة جيدة عن كيفية تقدم تجربتك، وإذا كنت بحاجة إلى تغيير شيء. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي نظام البروتين التي يمكن بلورتها بكميات كبيرة. ويمكن أن يحدث رد الفعل عن طريق الأشعة السينية الخفيفة أو الاختلاط السريع.
يمكن للدراسات الديناميكية على سلسلة من الهياكل أن توفر نظرة ثاقبة حول كيفية عمل البروتينات.
نظرة عامة
يقدم هذا المقال دليلاً شاملاً لتحضير عينات الهدف الثابت، وجمع البيانات، ومعالجتها لعمليات علم البلورات المتسلسلة باستخدام السينكروترون في خط الأشعة I24 بمركز Diamond. ويركز المقال على المنهجية المتبعة لإجراء التجارب باستخدام كميات محدودة من العينات مع ضمان سلامة الشريحة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- البيولوجيا البنيوية
- علم البلورات
- ديناميكيات البروتين
خلفية علمية
- تعد بلورات الأشعة السينية المتزامنة المتسلسلة (SSX) مجالاً متطوراً في علم البلورات الجزيئية الكبيرة.
- وهي مناسبة للتجارب التي تتطلب جرعات منخفضة ودرجة حرارة الغرفة.
- تسمح تقنية SSX بإجراء دراسات ديناميكية للبروتينات، مما يمكن من تصور آليات عملها.
- كما يمكن لتقنية SSX ذات الهدف الثابت استخدام كميات محدودة من العينات بشكل فعال.
الغرض من الدراسة
- توفير بروتوكول مفصل لعملية تشتت الأشعة السينية للمصدر الثابت (fixed-target SSX) في خط شعاع Diamond I24.
- ضمان الإعداد والمحاذاة الصحيحة للشريحة من أجل جمع بيانات مثالية.
- تسليط الضوء على الاختلافات في معالجة البيانات مقارنة ببيانات التدوير القياسية.
الطرق المستخدمة
- تحضير رقاقات السيليكون باستخدام رقائق البوليستر وتقنيات الختم.
- تطبيق ملاط البلورات الدقيقة على الرقاقات والشفط بالتفريغ.
- محاذاة الرقاقات باستخدام واجهة مستخدم رسومية عند خط الحزمة.
- تصوير البيانات ومعالجتها في الوقت الفعلي باستخدام مسارات عمل مؤتمتة.
النتائج الرئيسية
- يؤدي المحاذاة الناجحة للرقائق إلى جمع بيانات دقيقة.
- مراقبة فورية لمعدلات الفهرسة والتكامل أثناء التجارب.
- يكشف التصوير المرئي لمعاملات وحدة الخلية عن الأشكال المتعددة وتأثيرات التحميل.
- توفر الدراسات الديناميكية رؤى حول الوظائف البروتينية.
الاستنتاجات
- يعمل هذا البروتوكول على تعزيز كفاءة تجارب SSX ذات الهدف الثابت.
- يعد التعامل السليم مع الشريحة ومحاذاتها أمرين بالغَي الأهمية لنجاح عملية جمع البيانات.
- يمكن للدراسات الديناميكية باستخدام SSX أن تساهم بشكل كبير في تعزيز فهمنا لسلوك البروتين.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تتيح بلورة الأشعة السينية المتزامنة المتسلسلة ذات الهدف الثابت لعلماء البيولوجيا البنيوية إجراء دراسات ديناميكية للبروتينات باستخدام كميات محدودة من العينات، مما يدعم التحقق من الأهداف من خلال رؤى بنيوية عالية الدقة. وتقلل هذه الطريقة من استهلاك العينات مع الحفاظ على جودة البيانات، وهو أمر بالغ الأهمية في مراحل الاكتشاف المبكرة حيث يمثل التعبير عن البروتين وتنقيته عوائق أساسية. ومن خلال تسهيل التجارب في درجة حرارة الغرفة والتجارب المحددة زمنياً، فإنها تعزز الفهم الميكانيكي لوظيفة البروتين، مما يوجه جهود تحسين المركبات الرائدة وتقليل المخاطر في مرحلة التطوير قبل السريري.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال رصد تشكيلات البروتين أثناء عملها، مما يدعم التحقق الوظيفي من الأهداف.
- القيمة التشغيلية: تقلل من الاعتماد على أحجام البلورات الكبيرة، مما يسمح بفحص الأهداف الصعبة ذات عوائد التعبير المحدودة.
- الثقة التنبؤية: توفر بيانات هيكلية تفيد في توصيف موقع الارتباط وآلية العمل، مما يحسن قرارات اختيار الأهداف.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يعمل على إنشاء خرائط كمية لكثافة الإلكترونات من البلورات الدقيقة، مما يتيح إجراء تقييمات دقيقة لارتباط اللجندات.
- القيمة التشغيلية: يوحد عمليات تثبيت العينات ومحاذاتها عبر أنظمة قائمة على الرقائق، مما يحسن قابلية التكرار عبر حملات الفرز.
- جاهزية المقايسة: ينتج مقاييس فورية لمعدل الإصابة والفهرسة تدعم قرارات المتابعة أو التوقف أثناء فرز الشظايا أو المركبات.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يكشف عن الأشكال متعددة الأشكال والتغيرات التشكيلية التي قد تؤثر على ارتباط الدواء أو استقراره، مما يوجه استراتيجيات الصياغة.
- القيمة التشغيلية: يلتقط بيانات هيكلية محددة زمنياً يمكن ربطها بالمقاييس الوظيفية، مما يعزز مواءمة المؤشرات الحيوية الترجمية.
- تخفيف المخاطر: يحدد الشوائب الناتجة عن التحميل أو تأثيرات الجفاف في مرحلة مبكرة، مما يقلل من خطر التفسير الخاطئ في عمليات التحسين اللاحقة.
تكامل مسار العمل والعمليات
يتكامل تحليل الأشعة السينية للمستهدفات الثابتة (Fixed-target SSX) ضمن سير عمل الاكتشاف بعد تحديد المستهدف وتطوير المقايسة، مما يوفر رؤى هيكلية توجه عملية تحديد المركبات الرائدة والتحقق قبل السريري. كما يدعم دورات "التصميم-التصنيع-الاختبار-التحليل" التكرارية من خلال تقديم تغذية راجعة هيكلية سريعة حول ارتباط المركبات وديناميكيات البروتين.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات من خلال تصور التغيرات التشكيلية المستحثة بالربيطة وديناميكيات البروتين ذات الصلة بآلية العمل.
- الفحص: تتيح الجاهزية للمقايسات من خلال تحضير ومحاذاة الرقائق الموحدة، مما يضمن جودة بيانات متسقة عبر عمليات فحص المركبات.
- التحليلات: توفر مخرجات كمية تشمل معلمات خلية الوحدة، ومعدلات الإصابة، ومقاييس التكامل التي تسمح بالمقارنة الموضوعية للظروف التجريبية.
- الأبحاث الانتقالية: تربط الملاحظات البنيوية بالنتائج الوظيفية من خلال الكشف عن الديناميكيات التي قد تؤثر على التوافر الحيوي أو الارتباط بالهدف.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام للفحص البنيوي عبر أهداف متعددة، مما يقلل من جهود إعادة التحقق في بيئات المشاريع المتعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من صحة الهدف من خلال توفير بيانات هيكلية عالية الدقة ومحددة زمنياً تحت ظروف قريبة من الظروف الفسيولوجية.
- القيمة التشغيلية: تعزز قابلية التكرار والتوسع من خلال توحيد طرق التعامل مع الرقاقة، وبروتوكولات المحاذاة، ومسارات معالجة البيانات الآلية.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن كفاءة رأس المال عن طريق تقليل استهلاك العينات وتمكين التكرار السريع في حملات التحسين الهيكلي.
- التأثير على المحفظة: تدعم قرارات التقدم المعدلة حسب المخاطر من خلال تقليل الغموض الميكانيكي في تفاعلات الهدف والربيطة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في علم البلورات الجزيئية الكبيرة وإلماماً بتقنيات التعامل مع العينات القائمة على السينكروترون.
- يعتمد على إمكانية الوصول إلى البنية التحتية لخط الحزمة المزودة بتثبيت كينماتي، ورؤية على المحور، ومسارات بيانات مؤتمتة مثل DIALS.
- يستلزم توحيد المعايير بين الفرق في تحضير الرقاقات، والشفط بالتفريغ، وإجراءات المحاذاة لضمان اتساق البيانات.
- يتضمن اعتبارات التكيف مع أحجام البلورات والمجموعات الفراغية المختلفة، مما يتطلب ضبط اختيار الفتحة وتقنيات التوزيع.
- يشمل قيوداً عملية مثل هشاشة الرقاقة أثناء التحميل والتنظيف، والحساسية تجاه تأثيرات التجفيف التي قد تغير جودة البلورات بمرور الوقت.
