تحليل توليف الدهون المحايدة في Saccharomyces cerevisiae بواسطة وضع العلامات الأيضية وكروماتوغرافيا طبقة رقيقة

وتستخدم هذه التقنية أدوات توجد عادة في معظم البيئات المختبرية وتسمح بتحليل عدة عينات في وقت واحد. يمكن أن توفر هذه الطريقة رؤى رئيسية حول كيفية تنظيم إنزيمات التمثيل الغذائي للدهون في السياق الخلوي وفي خلفيات وراثية مختلفة. تلقيح مستعمرة من لوحة ثقافة الخميرة إلى 20 ملليلتر من وسائل الإعلام SC تحتوي على 2٪ dextrose واحتضان في 30 درجة مئوية لليلة واحدة مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة.

في اليوم التالي، تمييع الثقافة في 50 ملليلتر من وسائل الإعلام الطازجة إلى OD النهائي من 0.2 وتنمو لمدة 24 ساعة حتى يتم التوصل إلى مرحلة ثابتة. إعداد اثنين من aliquots 20 ملليلتر من إخماد العازلة لكل عينة وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية. في وقت واحد، وإعداد وسائل الإعلام ال تسمية إشعاعية عن طريق إضافة ملح الصوديوم حمض الخليك إلى وسائط SC dextrose الحرة بتركيز نهائي قدره 10 ميكروكوري لكل ملليلتر.

جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 4، 100 × ز لمدة 10 دقائق. إزالة supernatant وغسل بيليه الخلية مرة واحدة مع 20 ملليلتر من وسائط SC dextrose الحرة. جمع الخلايا مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي في 4، 100 × ز لمدة خمس دقائق ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي ميكرولتر اثنين المسمى باستخدام وسائل الإعلام الحرة dextrous.

طرد الخلايا لمدة دقيقتين أخريين. إعادة تشغيل الخلايا في 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام SC dextrose الحرة وتبدأ فترة التسمية الإشعاعية عن طريق إضافة بسرعة 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام التسمية الإشعاعية إلى كل تعليق الخلية. احتضان الأنابيب في حاضنة دوارة في 30 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

وفي الوقت نفسه، قبل تبريد الطرد المركزي مجهزة لأنابيب مخروطية 50 ملليلتر إلى ناقص 10 درجة مئوية وذوبان واحد 20 ملليلتر aliquots من إخماد العازلة. بمجرد انتهاء فترة التسمية الإشعاعية استخدام ماصة لإغراق عينة ملليلتر واحد بأكمله في مخزن مؤقت لإرواء مذاب على الجليد. جمع بيليه الخلية عن طريق الغزل في جهاز طرد مركزي المبردة مسبقا في 5, 000 × ز لمدة ثلاث دقائق وإضافة 20 ملليلتر من العازلة التبريد التبريد الطازج.

دوامة ويهز العينات لإعادة إنفاقها بالكامل في إخماد العازلة والطرد المركزي العينات مرة أخرى لجمع الخلايا. مرة واحدة هي بيليه الخلايا، وإزالة تماما كل عازلة التبريد من العينات عن طريق صب قبالة supernatant وإزالة الزائدة مع ماصة. تخزين الأنابيب في ناقص 80 درجة مئوية لمزيد من المعالجة.

تزن 0.3 غرام من حبات الزجاج الحمضي غسلها لكل عينة وتخزينها في اثنين من أنابيب الطرد المركزي ميكرولتر على الجليد. إزالة الكريات الخلية من الفريزر ناقص 80 درجة ووضعها على الجليد. ثم أضف 350 ميكرولتر من الميثانول و700 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى كل عينة وإعادة إنفاق الخلايا.

نقلها إلى أنابيب الطرد المركزي الصغيرة التي تحتوي على حبات زجاجية وزنها مسبقا. ليس الخلايا عن طريق الدوامة ثلاث مرات لمدة دقيقة واحدة، مع حضانة 30 ثانية على الجليد بين التحريضات. صب الخلايا في أنبوب الطرد المركزي الزجاج 15 ملليلتر وتسمية أنبوب A.Wash أنبوب الطرد المركزي الدقيق مع ملليلتر واحد من الميثانول، دوامة ذلك، وصب الميثانول في أنبوب A.Add اثنين من ملليلتر من الكلوروفورم تليها 400 ميكرولتر من الماء إلى أنبوب A لحجم عينة النهائي من 4.45 ملليلتر.

دوامة العينات لمدة دقيقة واحدة تليها جهاز طرد مركزي لمدة خمس دقائق في 1000 × ز لفصل واضح بين المراحل المائية والعضوية مع حطام الخلية ملقاة على واجهة. باستخدام ماصة مرعى زجاجي، اجمع المرحلة العضوية في أنبوب طرد مركزي زجاجي جديد يحمل علامة B وأضف ملليلتر واحد من كلوريد البوتاسيوم المولاري. إضافة ملليلتر واحد من الميثانول واثنين من ملليلتر من الكلوروفورم إلى أنبوب A وتكرار دوامة وخطوات الطرد المركزي.

دوامة والطرد المركزي أنبوب B لفصل المرحلة المائية والعضوية. إزالة الطبقة المائية العليا وجمع الطبقة العضوية أسفل كامل في قارورة زجاجية أربعة ملليلتر. تتبخر تماما المذيبات من مقتطفات الدهون عن طريق التجفيف تحت الغاز الخامل وتسخين الفرن إلى 145 درجة مئوية لتسخين لوحة TLC.

تحديد الكميات النسبية من الخلايا التي تناولتها قبل تحميلها على لوحة TLC. إعادة تشكيل عينة الدهون في 40 إلى 50 ميكرولتر من الكلوروفورم والميثانول مختلطة بنسبة واحد إلى واحد عن طريق الدوامة لمدة خمس دقائق. إعداد 101 ملليلتر من المذيب المرحلة المتنقلة في اسطوانة تخرج الزجاج.

ثم، صب المذيبات في غرفة TLC الزجاج تحتوي على 20 في 20 TLC وسادة التشبع وغطاء ضيق المناسب. إعداد توجيه 20 من قبل 20 هلام السيليكا 60G لوحة ووضع علامة على خط 1.5 سم فوق الجزء السفلي من لوحة باستخدام قلم رصاص. مرة واحدة وقد تم تسخين لوحة بما فيه الكفاية وتشبع لوحة التشبع TLC مع المذيبات، وإزالة لوحة TLC من الفرن والمضي قدما على الفور لتحميله.

باستخدام ماصة، بقعة خمسة ميكرولترات من العينة على أصل كل حارة تقع 1.5 سم فوق الجزء السفلي من لوحة TLC وتكرار التحميل حتى 20 إلى 40 ميكرولتر من العينة قد تم تحميلها في كل حارة. مرة واحدة وقد تم تحميل معيار والعينات، ووضع لوحة في غرفة النامية والانتظار حتى المذيبات قد وصلت إلى الجزء العلوي من لوحة. عندما يتم تطوير اللوحة بالكامل، قم بإزالتها من الغرفة واتركها تجف في غطاء الدخان لمدة 20 دقيقة.

بعد تجفيف اللوحة، قم بتغطيتها بفيلم بلاستيكي ووضعها في كاسيت متطور بشاشة تصوير تلقائي. قم بإزالة الشاشة من شريط كاسيت النامية ووضعها داخل صور الفوسفور. رش لوحة TLC مع ع-Anisaldehyde كاشف حتى تشبع السيليكا، ثم خبز في فرن 145 درجة لمدة خمس دقائق أو حتى ظهرت العصابات.

لقياس أنواع الدهون، كشط هلام السيليكا التي تحتوي على أنواع الدهون الفردية ونقلها إلى قارورة التلألؤ الزجاج. إضافة ستة ملليلتر من السائل التلألؤ ودوامة بقوة حتى تم تخفيض الفرقة السيليكا إلى قطع صغيرة. ضع الحامل مع قنينات التلألؤ في عداد التلألؤ وعد عن طريق ضبط وقت العد إلى دقيقتين لكل قارورة.

التصوير الفوسفوري يسمح لتصور autoradiogram من الأحماض الدهنية الخالية من التسمية، triacylglycerol، diacylglycerol، والكوليسترول، والقذارة. وقد ثبت أن الأنواع الدهنية المنقى يمكن فصلها في هذه الطريقة وتصور في وقت لاحق عن طريق رش لوحة TLC مع كاشف ف-أنيسالدهيد. وتشمل الأنواع المرئية جميع الدهون المذكورة سابقا بالإضافة إلى استر العقيمة.

من خلال تطبيق فترة مطاردة 10 دقيقة في وسائل الإعلام الخالية من البيل الإشعاعي بعد النبض ، لوحظ في المجموعة الرئيسية من القذارة اختفت وارتفع الكوليسترول الكلي. وبالمثل، فإن ظهور diacylglycerol في فترة مطاردة يرتبط مع انخفاض في إشارة الأحماض الدهنية الحرة. قبل تنفيذ البروتوكول الكامل، من المهم تحديد ما إذا كانت الخلايا سوف تمتص الخلايا من الخلايا الحمضية الخليكية في حالة النمو والخلفية الوراثية للاهتمام.