توليد وتوسيع خلايا القلب البشرية من خلايا الدم المحيطية المريض أحادية النووية
فبراير 12, 2021
هنا، نقدم بروتوكولا لتوليد وتوسيع خلايا القلب البشرية بقوة من خلايا الدم المحيطية أحادية النووية المريض.
هذا هو مرافق بروتوكول شامل، الخام يعزز توليد، واستخدام pouncing من المريض محددة، والثقافات من خلايا الدم المحيطية أحادية النووية. هذه التكتيكات قابلة للاستنساخ وسهلة المتابعة ، خاصة للمبتدئين. ولا تتطلب، خبير خاص في أغاني الخلايا الجذعية، أو طب القلب والأوعية الدموية.
يمكن استخدام بروتوكولنا لتوليد خلايا القلب الخاصة بالمرضى من سحب دم واحد يمكن استخدامه لنمذجة أمراض القلب والأوعية الدموية واختبار سمية القلب للأدوية الجديدة. يتطلب هذا البروتوكول التزاما طويلا بإعادة برمجة الخلايا الجذعية والتمايز الموجه. ومع ذلك، كنت حقا نقدر مساعيكم.
عندما ترى ضرب خلايا القلب في الطبق. عندما تصل مستعمرات iPSC البشرية إلى أكثر من 90٪ التقاء ، اشطف كل بئر بثلاثة ملليلترات من DPBS قبل علاج الخلايا بميليلتر واحد من 0.5 ملليمولار EDTA في DPBS لكل بئر عند 37 درجة مئوية. بعد خمس إلى ثماني دقائق، إضافة ملليلتر واحد من iPSC تمرير المتوسطة إلى كل بئر وإزاحة الخلايا يدويا.
نقل 600 إلى 900 ميكرولتر من الخلايا إلى الآبار الفردية لديها غشاء الطابق السفلي المغلفة ستة لوحة بئر لاحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. ثم قم بتحديث الثقافات مع اثنين من ملليلتر من المتوسط E8 كاملة كل يوم لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام. عندما وصلت الثقافة إلى التقاء، استبدل الوسط بميليلترين من وسيط تمايز عضلة القلب، اثنان لكل بئر.
في اليوم الثاني، استبدل المضادات الفائقة بميليلترين من تمايز عضلة القلب المتوسطة. في اليوم الثالث، استبدل المضادات الفائقة بميليلترين من تمايز عضلة القلب المتوسطة الثالثة. في اليوم الخامس
استبدال supernatant مع اثنين من ملليلتر من التمايز cardiomyocyte متوسطة واحدة. في اليوم السابع إلى العاشر، استبدل الناطقة الفائقة بميليلترين من تمايز عضلة القلب المتوسطة الرابعة. في اليومين 11 و 13.
عند ملاحظة الخلايا المتعاقدة، استبدل الناطقة الفائقة بميليلترين من تمايز عضلة القلب المتوسطة الخامسة. في الأيام 15 و 17 و 19 و 21. استبدال supernatant مع اثنين من ملليلتر من التمايز cardiomyocyte المتوسطة أربعة.
بعد مرحلة ما قبل الثقافة مع كامل المتوسطة الدم في سبعة أيام، أصبح PBMC كبيرة مع نواة مرئية والسيتوبلازم مما يدل على أنهم على استعداد لtransfection مع عوامل إعادة برمجة فيروس سينداي. عند تقديم لإكمال المتوسطة E8. سوف ترفق الخلايا المبرمجة بالكامل وتبدأ في تشكيل المستعمرات.
بعد أربعة إلى خمسة مقاطع، سوف تتشكل مستعمرات iPSC نقية للغاية من الخلايا المبرمجة مع عدد قليل جدا من الخلايا المتمايزة التي لوحظت. في هذه المرحلة، معظم الخلايا هي OCT4 وNANOG إيجابية مؤشرا على pluripoteny بهم. عادة ما يلاحظ ضرب خلايا القلب بعد 12 يوما من التمايز.
بعد المجاعة الجلوكوز، وإعادة تمثيل المعارض iPSC cardiomyocytes، والضرب التلقائي، وهيكل ساركومير الانحياز مع تروبونين القلب المتشابكة T وتعبير أكتينين ألفا. تحتفظ المستعمرات بنقاوتها كما يتضح من تعبيرها T تروبونين. على الرغم من أن خلايا القلب iPSC غير ناضجة نسبيا بالمقارنة مع خلايا القلب الكبار.
أنها تظهر البطين وبطين مثل إمكانات العمل كما تقاس التصحيح بالجملة، المشبك. تعبر خلايا القلب البطينية عن سلسلة ضوء الميوسين الثانية ، في حين تتميز خلايا القلب الأذينية iPSC بتعبير NR2F2. تنشيط WNT تحفيز انقسام الخلية ويعزز التعبير عن المنظمين دورة الخلية.
ومن المثير للاهتمام، تنشيط WNT يحفز أيضا انتشار قوي من خلايا القلب iPSC في وقت مبكر لمقاطعتين بالمقارنة مع الضوابط، على الرغم من أن هذه القدرة التكاثرية يقلل مع مرور الوقت. تأكد من أن يتم توسيع PBMS مع النووية واضحة والسيتوبلازم قبل إدخال ناقلات إعادة برمجة iPSC كما شرط PBMs أمر بالغ الأهمية لإعادة برمجة iPSC. خلايا القلب الخاصة بالمريض ذات قيمة لنمذجة أمراض القلب والأوعية الدموية في المختبر وتوفير طن من الخلايا المانحة لعلاج الخلايا الجذعية القلبية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يسهل هذا البروتوكول عملية توليد وتوسيع الخلايا العضلية القلبية المحددة للمريض من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي. وقد صُمم ليكون قابلاً للتكرار ومتاحاً للباحثين، لا سيما المبتدئين منهم.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلوم
- طب القلب والأوعية الدموية
- بيولوجيا الخلايا الجذعية
خلفية علمية
- تعد الخلايا العضلية القلبية ضرورية لدراسة أمراض القلب.
- يمكن للخلايا المستمدة من مرضى محددين أن تعزز من نمذجة الأمراض.
- تعتبر الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي مصدراً غير جراحي.
- تتطلب إعادة برمجة الخلايا الجذعية صيانة دقيقة.
الغرض من الدراسة
- تطوير بروتوكول لتوليد الخلايا العضلية القلبية من عينات الدم.
- تمكين نمذجة أمراض القلب والأوعية الدموية.
- اختبار السمية القلبية للأدوية الجديدة.
الطرق المستخدمة
- جمع الخلايا أحادية النواة من الدم المحيطي.
- تقنيات إعادة برمجة الخلايا الجذعية.
- التمايز الموجه إلى خلايا عضلية قلبية.
- بروتوكولات الحفاظ على المزارع الخلوية لفترات طويلة.
النتائج الرئيسية
- التوليد الناجح لخلايا عضلة القلب الخاصة بالمريض.
- قابلية تكرار البروتوكول لمختلف العينات.
- جدوى التطبيق للمبتدئين الذين يفتقرون إلى الخبرة الواسعة.
- التطبيقات المحتملة في اختبار الأدوية ونمذجة الأمراض.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول نهجاً عملياً للباحثين.
- وهو يدعم التطورات في أبحاث القلب والأوعية الدموية.
- ويمكن للدراسات المستقبلية أن تستند إلى هذه المنهجية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح توليد الخلايا العضلية القلبية الخاصة بالمريض من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي نمذجة للأمراض واختبارات لسمية القلب بشكل قابل للتطوير والتكرار. ويدعم هذا النهج عملية التحقق من الأهداف في المراحل المبكرة وتحديد المركبات الرائدة من خلال توفير أنظمة خلوية ذات صلة بالبشر. كما يقلل من الاعتماد على النماذج الحيوانية ويعزز الثقة التنبؤية في البحوث القلبية الوعائية قبل السريرية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية باستخدام الخلايا العضلية القلبية المشتقة من المرضى والتي تعكس الخلفيات الجينية للمرض.
- القيمة التشغيلية: تدعم الحد من المخاطر البيولوجية من خلال التقييم الوظيفي لقدرة الانقباض والخصائص الفيزيولوجية الكهربائية.
- القيمة التنبؤية: تسهل توضيح المسارات والحد من المخاطر الميكانيكية لأهداف القلب والأوعية الدموية قبل مرحلة تحسين المركبات الرائدة.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: إنتاج مجموعات من الخلايا العضلية القلبية النابضة والقابلة للتوسع، بما يتناسب مع المقايسات الوظيفية عالية المحتوى.
- القيمة التشغيلية: تقديم قراءات كمية وقابلة للتكرار، بما في ذلك عوابر الكالسيوم ومدة جهد المجال، لغرض فحص المركبات.
- جاهزية المقايسة: تمكين منصات قياسية قائمة على الطبقة الواحدة متوافقة مع أنظمة التصوير المؤتمتة والفيزيولوجيا الكهربائية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يحاكي الأنماط الظاهرية للخلايا العضلية القلبية البطينية والأذينية البشرية لدراسة الآليات ذات الصلة بالأمراض.
- القيمة التشغيلية: يدعم التوسع الطولي باستخدام CHIR99021 لتوليد أعداد كافية من الخلايا للدراسات التمكينية لتقديم طلب عقار جديد (IND).
- الاستمرارية الانتقالية: يربط بين مرحلة الاكتشاف والتحقق قبل السريري من خلال أنظمة خلوية متسقة ومحددة لكل مريض.
تكامل سير العمل والمسارات التحليلية
تتكامل هذه الطريقة ضمن سلسلة عمليات الاكتشاف، بدءاً من التحقق من الهدف، مروراً بتحديد المركبات الرائدة، وصولاً إلى تقييم السلامة قبل السريرية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تتيح اختبار الفرضيات من خلال التمايز الموجه للخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) إلى أنواع فرعية ناضجة وظيفياً من الخلايا العضلية القلبية.
- الفحص: توفر خلايا عضلية قلبية نشطة كهربائياً وجاهزة للمقايسة من أجل تحليل القنوات الأيونية وقابلية الانقباض.
- التحليلات: تُنتج بيانات عن جهد الفعل والتعامل مع الكالسيوم لدعم التحليل المقارن للمركبات.
- الأبحاث الانتقالية: تحافظ على الصلة المظهرية بدءاً من اشتقاق الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) ووصولاً إلى التوسع والتوصيف.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس لسير عمل قابل للتوسع وغير جراحي لتوفير الخلايا، ويكون قابلاً للتطبيق عبر برامج متعددة لأمراض القلب والأوعية الدموية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة في التحقق من صحة الهدف من خلال نماذج خلوية مطابقة جينياً وذات صلة بالبشر.
- القيمة التشغيلية: تضمن قابلية التكرار والتوحيد القياسي عبر بروتوكولات محددة لتمايز وتوسيع الجزيئات الصغيرة.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال تمكين الكشف المبكر عن مخاطر السمية القلبية.
- تأثير المحفظة: تدعم التقدم المعدل حسب المخاطر من خلال تقليل فشل الترجمة في دواعي الاستعمال القلبية الوعائية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في زراعة الخلايا الجذعية، وإعادة برمجة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC)، والتمايز القلبي.
- يعتمد على أوساط زراعة محددة، وجزيئات صغيرة (CHIR99021)، ومنصات مطلية بالمصفوفة خارج الخلوية.
- يستلزم وجود إجراءات تشغيل قياسية لعمليات تمرير الخلايا، وتوقيت التمايز، ومراقبة الجودة.
- يتطلب مراقبة التكيف عند التوسع في استخدام خطوط iPSC المختلفة المشتقة من المرضى.
- يتقيد بعدم نضج الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC نسبياً مقارنة بنظيراتها البشرية البالغة.
