تنقية وتوسيع الخلايا T القاتل الطبيعي الثابت الماوس في المختبر وفي دراسات في الجسم الحي

نحن نصف بروتوكول سريع وقوي لإثراء الخلايا القاتل الطبيعي الثابت T (iNKT) من طحال الماوس وتوسيعها في المختبر إلى أرقام مناسبة للدراسات المختبرية وفي الجسم الحي.

هذا البروتوكول يتيح تنقية الخلايا التائية الحبر، والتي هي نادرة جدا، ويسمح للتوسع 30 أضعاف في عددهم. يمكن إجراء تنقية في يوم واحد وإنتاج عدد كبير من الخلايا التائية الحبر جاهزة للاستخدام في الجسم الحي وفي المختبر الدراسات في غضون أسبوعين. إثبات الإجراء سيكون غلوريا دلفانتي، ما بعد الوثيقة في المختبر.

بعد تشريح طحال الماوس، سحق من خلال مصفاة خلية 70 نانومتر للحصول على تعليق خلية واحدة في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني مع 2٪FBS. جهاز طرد مركزي في 300 مرة G لمدة خمس دقائق. إزالة supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية مع ملليلتر واحد من كلوريد الأمونيوم المعقمة البوتاسيوم يسين العازلة.

احتضان الخلايا لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم كتلة مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني مع 2٪FBS. جهاز طرد مركزي في 300 مرة G لمدة خمس دقائق. بعد إزالة supernatant، resuspend بيليه الخلية في ثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني مع 2٪ FBS وإزالة بقايا الدهون عن طريق الأنابيب.

لخطوات التخصيب، والحفاظ على الخلايا الباردة واستخدام حلول تبريد مسبق في أربع درجات مئوية ومن ثم الاحتفاظ بها على الجليد. جهاز طرد مركزي في 300 مرة G لمدة خمس دقائق. Resuspend جميع الخلايا في المبلغ المناسب من برنامج تلفزيوني مع 2٪ FPS و Fc مانع واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

اغسله بما بين ملليلتر واحد ومليلترين من حاجز فصل MACS لكل 10 ملايين خلية وطارد مركزي بمعدل 300 مرة G لمدة 10 دقائق. بعد إزالة النافورة، وصمة عار الخلايا مع CD19-FITC وH2-IAb-FITC واحتضان لمدة 15 دقيقة في الظلام في أربع إلى ثماني درجات مئوية. اغسل الخلايا بإضافة ملليلتر واحد إلى اثنين من المخزن المؤقت MACS لكل 10 ملايين خلية وطارد مركزي بمعدل 300 مرة G لمدة 10 دقائق.

إزالة supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية في 90 ميكرولتر من العازلة MACS لكل 10 مليون خلية. إضافة 10 ميكرولتر من الميكروبات المضادة ل FITC لكل 10 ملايين خلية. تخلط جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة في الظلام في أربع إلى ثماني درجات مئوية.

اغسل الخلايا بإضافة ملليلتر إلى ملليلترين من المخزن المؤقت MACS لكل 10 ملايين خلية وطارد مركزي بمعدل 300 مرة G لمدة 10 دقائق. إزالة supernatant وإعادة إنفاق ما يصل إلى 125 مليون خلية في 500 ميكرولتر من العازلة MACS. ضع عمود LD في المجال المغناطيسي لمفصل MACS.

لتجنب انسداد، تطبيق عامل تصفية ما قبل الفصل على العمود LD وشطفه مع اثنين من ملليلتر من المخزن المؤقت MACS. تطبيق تعليق الخلية على مرشح وجمع الخلايا غير البطاقة التي تمر عبر العمود. اغسل خزان العمود الفارغ ثلاث مرات بمللتر واحد من المخزن المؤقت ل MACS.

جمع النفايات السائلة المخصبة تي الخلية والعد الخلايا، وحفظ 50 ميكرولتر لتحليل FACS. بعد الطرد المركزي في 300 مرة G لمدة خمس دقائق، وإزالة supernatant وصمة عار الخلايا مع TETRAMER-PE CD1d. تخلط جيدا واحتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام على الجليد.

اغسل الخلايا بإضافة ملليلتر واحد إلى اثنين من المخزن المؤقت MACS لكل 10 ملايين خلية. بعد الطرد المركزي في 300 مرة G لمدة 10 دقائق، وإزالة supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية في 80 ميكرولتر من العازلة MACS لكل 10 مليون خلية. إضافة 20 ميكرولتر من الميكروبات المضادة PE لكل 10 مليون خلية.

تخلط جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة في الظلام في أربع إلى ثماني درجات مئوية. اغسل الخلايا بإضافة ملليلتر واحد إلى اثنين من المخزن المؤقت MACS لكل 10 ملايين خلية وطارد مركزي بمعدل 300 مرة G لمدة 10 دقائق. إزالة supernatant وإعادة إنفاق ما يصل إلى 100 مليون خلية في 500 ميكرولتر من العازلة MACS.

وفقا لعدد الخلايا، ضع عمود LS أو MS في المجال المغناطيسي لفاصل MACS وشطف العمود بحاجز MACS. تطبيق تعليق الخلية على العمود، وجمع الخلايا غير البطاقة التي تمر من خلال وغسل العمود ثلاث مرات كما هو موضح سابقا. هذا هو الكسر السالب

قم بإزالة العمود من المجال المغناطيسي ووضعه على أنبوب تجميع جديد. ماصة MACS المخزن المؤقت على العمود ودفع المكبس المقدمة في العمود لطرد الكسر الإيجابي المخصب في الخلايا التائية الحبر. لزيادة استعادة الخلايا التائية INK، قم بالطرد المركزي للكسر السالب عند 300 مرة G لمدة 10 دقائق وكرر الخطوات السابقة باستخدام عمود LS أو MS جديد.

سحب الكسور الموجبة وتحديد عدد الخلايا. احتفظ ب 50 ميكرولتر من الكسور الإيجابية والسلبية لتحليل FACS للتحقق من النقاء. لتنشيط خلايا INK T بنسبة واحد إلى واحد، قم بنقل الحجم المناسب من الخرز المغناطيسي المضاد للCD3 وCD28 إلى أنبوب وبحجم متساو من PBS، ثم دوامة لمدة خمس ثوان.

ضع الأنبوب على مغناطيس لمدة دقيقة واحدة وتجاهل العملاق. إزالة أنبوب من المغناطيس وإعادة إنفاق الخرز المغناطيسي غسلها في الحجم المناسب من RPMI. أجهزة الطرد المركزي تنقية الحبر تي الخلايا في 300 مرة G لمدة خمس دقائق ومزجها مع الماوس تي المنشط المضادة CD3 أو CD28 الخرز المغناطيسي.

لوحة ملليلتر واحد من تعليق الخلية، والخرز المغناطيسي المضادة CD23 وCD28 في لوحة 48 جيدا مع 20 وحدة لكل ملليلتر IL-2، ثم احتضان في 37 درجة مئوية. بعد خمسة أيام، أضف 10 نانوجرامات لكل ملليلتر IL-7. تقسيم الخلايا إلى نصفين عندما تصل إلى 80 إلى 90٪ التقاء، مضيفا دائما 20 وحدة لكل ملليلتر IL-2 و 10 نانوغرام لكل ملليلتر IL-7.

في ظل هذه الظروف، يمكن توسيع خلايا INK T لمدة تصل إلى 15 يوما. باستخدام هذا البروتوكول، يتم إثراء الخلايا التائية INK من طحال الفئران المعدلة وراثيا من خلال عملية فصل المغناطيسية المناعية. بعد التخصيب ، يمكن توسيع الخلايا مع حبات مضادة للCD3 و CD28 ، مما يؤدي إلى توسع 30 ضعفا في المتوسط بحلول اليوم 14 من الثقافة.

التنشيط القوي مع مكافحة CD3 والخرز المضادة للقرص تسبب في downregulation التعبير TCR IMK T-الخلية على سطح الخلية وظهر السكان السلبية مزدوجة. غالبية الخلايا التائية الموسعة INK هي CD4 سلبية. جعل توصيف عوامل النسخ الخاصة بالنسب PLZF و ROR gamma T من الممكن تحديد الأنماط الظاهرية NKT1 و NKT2 و NKT17 على خلايا INK T المخصبة في اليوم صفر و14.

تظهر الخلايا التائية المخصبة INK النمط الظاهري الشبيه ب T80 ، والذي يتم الحفاظ عليه بعد 14 يوما من التوسع كما أكده إفراز كل من إنترفيرون غاما وIL-4 بعد PMA وتحفيز الأيونوميسين. أثناء خطوات تنقية، تذكر أن تعمل بسرعة مع حلول تبريد مسبق والتخلص من أي بقايا الدهون التي يمكن أن ينظر إليها أثناء الأنابيب. يمكن استغلال الخلايا التائية الموسعة INK لإجراء فحوصات في المختبر وفي عمليات نقل الجسم الحي إلى الفئران ، حتى بعد التعديلات الوظيفية عن طريق نقل الجينات أو تحريرها.

التوسع في المختبر من الخلايا التائية الحبر يتغلب على القيود التي تعطى من قبل ندرة, مما يجعلها قابلة للاستغلال في الدراسات قبل السريرية في مجالات مراقبة المناعة الورم, الأمراض المعدية, والمناعة الذاتية.